分子靶向探针在血栓诊断中的应用

汪楷淳，刘楚轩，郑元元

首都医科大学1基础医学院，3药学院，北京 100069；2北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京100083

血栓作为急性心肌梗死、缺血性脑卒中、肺栓塞等致死性疾病的发病原因，在世界范围造成了大量的死亡以及不可逆的器官和组织功能损伤［1-2］。其中急性心肌梗死和缺血性脑卒中是构成50岁以上人群死亡和伤残最高的两种因素，每年在全球范围造成了超过1240余万人死亡，占总死亡数的20%以上［3］。我国每年心血管疾病引起的死亡约占总死亡人数的40%，其中多数与血栓相关［4］。因此，实现早期对血栓的精准诊断有着十分重要的临床意义。

血栓的形成一般起自于血管壁的损伤［5］，内皮下基质暴露出胶原和组织因子。胶原能与循环中的血管性血友病因子结合，进而结合血小板上的GPIb/Ⅸ/V受体。在此过程中，伴随着血小板的活化和血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPⅡb/Ⅲa）的表达。GPⅡb/Ⅲa在血小板未激活时与纤维蛋白只有低亲和性，而活化后能够紧密结合纤维蛋白原，构成血小板间的连接，形成白色血栓。纤维蛋白原在凝血酶的激活下被转化为纤维蛋白，并聚集为纤维蛋白多聚体，网罗血细胞，形成红色血栓［6］。在凝血过程中，P-选择素介导血小板、内皮细胞黏附以及白细胞的滚动，常在血栓前期大量表达［7-8］。GPⅡb/Ⅲa仅在活化的血小板表面大量表达［9］，纤维蛋白在凝血酶的刺激下才能转化为纤维蛋白，血管性血友病因子也仅聚集于暴露出的内皮下基质。因此，GPⅡb/Ⅲa、纤维蛋白、血管性血友病因子以及P-选择素等［9］都可以作为血栓分子成像的靶点。

分子影像技术于1999年被首次提出［10-11］。该技术将分子生物学与医学影像学结合，使得影像诊断从解剖学层面精准到细胞和分子层面，并能定性和定量化的在早期诊断出病灶的位置和大小。分子影像技术可将基因表达和生物信号等微观且复杂的过程以直观的影像展现在人们面前，在分子细胞水平上即可充分地了解疾病的发生发展过程，有助于早期发现疾病的分子及病理改变，还可实现在活体上连续观察药物的效果。因此，分子影像技术可以推动疾病的早期诊断和治疗。众所周知，血栓性疾病常需要早期的诊断，错过黄金诊治期将会为患者的预后带来极大的不利。因此，构建具有血栓高特异性的分子探针，靶向血栓位置，并通过影像技术以高分辨示踪，将具有重要的研究意义和临床价值［12］。本文将主要从核素成像（SPECT/PET）、MRI、光学成像、超声成像以及多模态成像几个方面对分子靶向探针在血栓诊断中的应用进行一详细综述。

1 单一模态分子靶向探针在血栓诊断中的应用

1.1 核素成像（SPECT/PET）分子靶向探针

尽管目前MRI、CT以及超声都能够检测血栓，但只有核素成像可以进行全身性的血栓检查。由于核素成像具备高灵敏性，且可反映组织代谢的情况，因此在诊断新鲜血栓和微小血栓方面有着其他技术无法比拟的优势［13-14］。随着SPECT/CT和PET/CT等技术的发展，核素成像逐渐成为临床诊断血栓的一种重要方式。由于核素成像通常与CT一起使用，因此本文将PET/CT和SPECT/CT归为单一模态成像。

GPIIb/IIIa作为血小板膜上粘合蛋白，是参与血小板的聚集主要因子。有实验室构建了基于靶向活化的GPⅡb/Ⅲa的分子探针scFvantiLIBS-64CuMeCOSar，发现其能很大程度地增强PET对小鼠股动脉血栓的成像［15］。有学者在上述研究［15］的基础上，构建类似的分子探针scFvanti-GPIIb/IIIa-MeCOSar。以心肌缺血再灌注小鼠为模型，通过尾静脉注射分子靶向探针，在不同的心肌缺血和注射时间，获得了与血小板聚集和心肌缺血程度正相关的PET成像，展现了该分子探针在诊断心肌梗死和血栓方向的前景［16］。有学者应用可以靶向结合纤维蛋白的多肽，合成了99mTc-标记的分子靶向探针。通过SPECT检测小鼠颈动脉血栓时，发现其在血栓周围的成像能力高于阴性对照组的多肽探针［17］。有研究构建了能特异结合纤维蛋白的线性HYNICGPRPP和环状HYNIC-CGPRPPC两种多肽，并分别与99mTc连接［18］。两种分子靶向探针都具有靶向血栓的能力，其中环状的99mTc-HYNIC-CGPRPPC多肽显示出更强的结合能力，并在小鼠股动脉血栓模型中获得了清晰的血栓成像。有学者通过将靶向纤维蛋白的探针与p-TU-Bn-DOTA以及64Cu结合，构建出基于PET技术的分子靶向探针64Cu-FBP2，在小鼠颈静脉损伤模型中得到良好的血栓显影［19］。后续研究在此基础上，将p-TUBn-DOTA改为CB-TE2A，构建了64Cu-FBP7［20］。该探针在不影响靶向血栓的情况下，使血栓处和正常血液处的信号强度比例进一步增大。由于64Cu-FBP7合成时即便长时间加热也难以达到足够的纯度，还需要HPLC提纯等后续步骤，该试验室［21］构建了可以省去提纯步骤的64Cu-FBP12，虽然其显像效果不如以上的两种探针，但其反应的快捷性和纯度是上述两种探针难以比拟的。有学者利用64Cu、Al18F和两种特异性靶向纤维蛋白的多肽组建了四种核素探针，其中的三种在增强血栓成像能力的同时，有着良好的生物相容性［22］。不同于其它核素探针，另一研究考虑到造价昂贵的问题，选取了一种造价较为低廉的P-选择素—岩藻多糖［23］。他们用大鼠构建了腹主动脉瘤、感染性心内膜炎和心肌缺血再灌注3种模型，分别代表有生物活性的腔内血栓、血小板丰富的血栓和受损的心肌内皮。利用他们构建的分子探针99mTc-岩藻多糖，在3种模型中都获得了良好的血栓SPECT成像。但该探针的空间定位性仍有待提升。不同于大部分目前仍处于动物实验阶段的分子探针，也有一些探针进入了人体实验阶段。在一项灵长类动物实验［24］的基础上，有研究分别招募了10名有急性动脉血栓特征或近期接受过动脉介入或手术的志愿者和20名有肺栓塞或深静脉血栓的志愿者，测试了他们所合成的靶向GPIIb/IIIa受体的PET/CT探针18F-GP1，在静脉血栓和动脉血栓两个维度验证了其安全性和有效性［25-26］。

虽然核素成像目前仍存在检查费用高昂、分子探针的制备要求高和放射性等问题［13］，但以上研究展现了核素成像分子靶向探针在临床诊断血栓的广阔前景。在血栓诊断方面，核素成像因其检测全身的可行性和相对于CT的低放射性［13-14］，有望在全身体检和高危人群的定期检查中发挥不可替代的作用。

1.2 MRI分子靶向探针

有学者构建了靶向GPIIb/IIIa 的核磁探针LIBS MPIOs。该探针具有较高的敏感度，可以定量地检测血栓，并在颈动脉内膜剥脱术的病理标本上得到了其适用于人类的基本证据［27］。另有学者将靶向P-选择素的配体与T1造影剂Gd-DOTA结合，构建出只与活化血小板结合的分子探针CM8FS［28］。虽然该实验缺少核磁活体成像结果，但作为早期靶向血栓的核磁造影剂，推动了相关方向的发展。Caravan实验室构建了靶向纤维蛋白的EP-2104R，该探针有着精准的靶向选择性以及较高的弛豫率，并能够实现人与多种动物的血栓成像［29］。在随后的研究中，他们还发现二硫键是该探针能紧密性结合纤维蛋白的重要因素。EP-2104R可以在与活化血小板表面高度表达的蛋白质二硫键异构酶反应后发生空间结构的改变，从而能够与纤维蛋白更加紧密地结合［30］。有学者构建了靶向P-选择素的PsL-EGFmAb-BSA4-(Gd-DTPA)n，该顺磁性分子靶向探针有着很高的弛豫率，并在狗的股静脉血栓模型中得到了很好的血栓成像［31］。但由于P-选择素只在早期血栓中大量表达［7］，从而降低了该分子靶向探针的普适性。有研究基于Fe3O4和聚乳酸-羟基乙酸（PLGA），在表面修饰靶向GPIIb/IIIa的环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（cRGD），构建了Fe3O4-PLGA-cRGD NPs［32］。在大鼠腹主动脉血栓模型中得到良好成像，并通过血液学和病理学证明了其安全性和生物相容性。

1.3 超声成像分子靶向探针

与其它成像技术相比，超声成像具有成本低、无辐射和即时成像等优势，在血栓性疾病诊断中有着长期的运用和重要地位。在临床上，单纯的超声成像就能够诊断大部分血栓性疾病。然而，随着新型靶向造影剂的发展，超声成像技术在诊断新鲜血栓、微小血栓和心脏血栓等方面也逐渐发挥作用［33］。值得一提的是，不同于其他靶向探针主要偏向于成像能力，超声分子靶向探针常常能通过声孔效应［34］以及微泡的载药能力［35］进行溶栓，达到诊疗一体化的作用。

有学者利用可降解的聚异丁基氰基丙烯酸酯和岩藻多糖结合，构建一种全新超声微泡探针［36］。其中可降解的聚异丁基氰基丙烯酸酯做为功能性微泡，不仅表面可以连接多种靶向糖蛋白，也可以在超声信号下破裂，实现靶向给药。同时，岩藻多糖有靶向P-选择素的能力，在有剪切力情况下对活化的人血小板和小鼠血栓都有较好的靶向效果。该探针所具有的载药能力使其在诊疗一体化方面展现更多可能。

2 多模态分子靶向探针在血栓诊断中的应用

在影像学与多学科交叉融合发展的趋势下，出现了越来越多的集多种技术显像能力为一体的分子靶向探针，即多模态分子靶向探针。相比于单一模态分子靶向探针，多模态分子靶向探针可以整合多种影像技术的优势，例如集PET以及近红外荧光的敏感度、CT和MRI的高空间分辨率、超声探针微泡的载药能力等于一身，发挥更大的成像潜能。

2.1 PET/MRI双模态分子靶向探针

有学者将靶向纤维蛋白的EP-2104R探针中的Gd替换为64Cu，利用小鼠动脉血栓模型分别进行MRI和PET成像，发现在两种技术下都能够清晰地观察到血栓。其中MRI成像显示的血栓大小与实际大小相符，可以很准确地反映血栓的实际情况；而PET成像中血栓的大小略被夸大，但其有利于准确地发现血栓位置，各有其应用价值［37］。来自哈佛大学的研究者将靶向纤维蛋白的FBP8与核素64Cu结合，并在8位志愿者中进行了测试［38］。结果显示该探针代谢稳定，并能以极高的准确度检测急性和陈旧血栓。值得一提的是在其运用心脏核磁和PET的场景中，能够诊断危险并难以检测的左心耳血栓。

2.2 光学相关的双模态分子靶向探针

光声成像是一种合并了高对比度的光学成像和穿透性强的超声成像，具有可定量分析和良好生物安全性的新兴影像技术［39］，在血栓诊断中也可发挥作用［40］。

有实验室构建了基于光声成像和MRI技术的多种纳米分子探针，其中无论红血栓或白血栓，探针DDNP都有较佳的显像效果。实验中该课题组还发现，在注射探针后，MRI成像下发现血栓面积有明显的减小（30%的缩减比例），提示其还拥有一定的治疗作用［41］。有学者设计并合成了一种可以通过核磁、光学双模态成像的探针，通过可逆加成-断裂链转移聚合链接双环壬炔与二溴马来酰亚胺，再通过叠氮化物连接和无铜的点击反应，实现了伴随DBM偶联诱导的荧光［42］。共聚物中的二磷酸螯合了NaGdF4提供核磁能力，并和乙二醇共同提高了探针的稳定性与生物相容性。作者随后将scFv单抗与该纳米探针偶联，实现特异靶向活化的GPIIb/IIIa受体。体外实验验证了该探针具有良好的生物相容性、发光效果和靶向效率。

不同于一般血栓，微血栓造成微血管缺血，是无再灌注现象、心脏X综合征和血栓性微血管病的重要发病原因［43］。但目前大部分的对于血栓的检测手段都难以检测微循环中的血栓。针对这个问题，有学者将CREAK肽与超顺磁性氧化铁纳米粒和荧光基团结合，在大鼠心肌缺血再灌注模型中实现了多模态成像，即该纳米探针选择性地积聚在微血栓内，在核磁共振和荧光成像中均有良好显像［44］。

与CT、MRI等成像模式只能够提供晚期血栓的延迟间接显影相比，近红外荧光成像因其可提供实时直接和间接的血栓造影而在血栓的诊断中逐渐受到青睐［45］。有研究将近红外染料cy5.5与凝血酶激活肽（TAP）结合，使其能被凝血酶特异性剪切并发出荧光［46］。之后，进一步连接有着高X射线吸收系数的SiO4包埋的纳米金颗粒，得到TAP-SiO2@AuNPs。其中新鲜制备TAP在水溶液中会有一定的荧光猝灭，但当其结合凝血酶时，荧光强度提高了30.31倍，显示出巨大的差异性。另一方面，由于该纳米探针的尺寸大小适宜（39.8 nm），易于被纤维蛋白和红细胞的网状结构捕获并在血栓中累积，从而发挥纳米金颗粒的CT成像能力。在小鼠血栓模型中，该探针在近红外荧光和Micro-CT中均可获得清晰成像。该探针的价值在于，在急性血栓及血栓前期，近红外荧光成像可以高效检测到此时的凝血酶聚集。而在血栓后期，密集的网状结构可以捕获并累积该探针，从而实现对于血栓整个阶段的成像。美中不足的是，该探针只是利用尺寸而实现非特异性的血栓处聚集，其特异性还有待提高，另外也有进一步堵塞血栓或加剧血管狭窄的可能性。有学者将环状的精氨酸-甘氨酸-cRGD与PLGA表面结合以靶向血栓，通过进一步将吲哚菁绿（ICG）包埋于纳米探针中构建了具有双模态成像（光声和近红外荧光）和溶栓作用的PLGA-cRGDPFH-ICG NPs 探针［47］。其中cRDG 可以靶向GPIIb/IIIa，实现该探针的靶向性；ICG则提供了光声成像和近红外荧光成像的能力，并具有良好的空间分辨率和高灵敏度。与大多数分子靶向探针不同的是，该探针在PLGA 中包埋了在超声信号下能够相变的全氟乙烷（PFH）。超声作用下渗入到血栓内部的液相PFH可以迅速气化，体积增大。在提高超声信号强度的同时，PFH相变所产生的声穿孔和空化效应可以破坏周围的血栓，从而达到诊疗一体化的作用。也有研究利用相似的原理，加入了PLGA包埋的PFH［48］。不同的是，该课题组利用CREAK靶向肽靶向纤维蛋白，并通过引入Fe3O4得到光声成像的能力。

荧光断层扫描技术（FMT）具有组织穿透性强、背景荧光干扰低、荧光信号敏感度高、体内安全性良好等优势，是一种有望在血栓诊断中发挥作用的新技术［49］。Jaffer实验室利用靶向纤维蛋白的EP-2104R构建了能够在FMT-CT中灵敏检测血栓的FTP11-Cy7，在小鼠深静脉血栓模型得到了三维的血栓图像［50］。

3 总结与展望

能够诊断血栓的分子靶向探针在多学科技术的推动下已经获得了阶段性的成功，尤其伴随着近年来微纳米技术的蓬勃发展，分子靶向探针具有广阔的研究与应用前景。然而，目前大部分靶向探针依然存在着制备成本高，只停留在动物实验阶段，靶向效率、体内稳定性及生物安全性仍有待提高等方面的限制。特别是纳米探针属于相对新兴的材料学科，人们对其毒性的了解还未研究透彻，且大多数纳米探针的制备相对复杂，是否能够实现工业化的大规模生产也是急需解决的问题之一。但值得欣喜的是，随着近十年来分子探针技术的不断发展，已然可以从已有的研究中看到一些解决这些问题的途径。比如可以通过结合多个靶向位点提高结合血栓的特异性和稳定性［51］；通过选择生物自身来源的材料，如外泌体、细胞膜等制备或包裹探针来提高生物相容性［52］。由于靶向血栓的相关靶点有一定的物种差异性，要实现动物实验到临床实验的差距，还需要经历灵长类实验等大量的努力［53］。将来随着更多血栓标志物的发现，更多生物安全性更高、价格更低廉的分子材料的问世，相信在不久的将来，安全性高、稳定性好、靶向准确、显像灵敏乃至诊疗一体的分子靶向探针将成为研究与治疗血栓性疾病的一大助力。