甘肃省玉米品种DNA 指纹库构建进展

孟思远

（甘肃省种子总站，甘肃 兰州 730020）

随着农业现代化建设的推进，农作物良种在农业增产中的科技份额不断提高。种子是农业生产最重要的有生命的生产资料，种子检验是良种繁育的重要环节，其质量标准化和品质标准化是种子安全的重要保证。但由于我国现代种业仍存在产业集中度低、品种多乱杂散、行业监管能力不强、国际竞争能力弱等问题，加之种子企业活力尚未充分发挥、种子产销与育种科研衔接尚不紧密，难以适应我国种业竞争力的客观要求。《中华人民共和国种子法》《农业转基因生物安全管理条例》颁布实施以来，对种子质量监管又提出新的要求，常规4 项检测已无法满足现阶段的种子发展要求，种子质量监管不断将转基因成分鉴定、品种真实性分子检测等项目纳入质量监管要求。其中，DNA 指纹图谱就是品种真实性分子检测的重要判定依据，DNA 指纹相当于给每一玉米品种颁发一个身份证，通过玉米DNA 指纹图谱分析，一方面可以用于真实性检测，打击套牌品种的侵权违法行为，维护种子市场健康发展，保障农民的基本权益，助力我国粮食安全；另一方面DNA 指纹库的建成可以为育种家提供DNA 层面的数据支持，促进科技创新能力的持续提升，持续增强种业竞争实力，充分发挥种子企业的积极作用，推进育繁推一体化的现代种业健康发展，为实现“供种数量安全、种子质量安全、品种种植安全、种子产业安全”提供有力的政策支持和坚实的技术和数据保障，助力我国种业实现自主知识产权的转型性跨越，为我国解决种业“卡脖子问题”提供思路。

构建玉米标准DNA 指纹库立足于种业振兴，着眼于当前全省玉米种业发展的短板问题，以净化种业市场和保障全省种子质量安全为目标，通过构建省级玉米审定品种标准样品DNA 指纹库，既可以避免无对照样品导致无法检测的问题，还可以解决反复检测标准样品造成的浪费；同时还能快速根据图谱查找相似品种，提供直观有效的对比数据，助力完善全省种子质量检测体系和市场监管体系。督促制种企业提升质量控制意识，继而提高企业自主创新能力、知识产权保护能力、企业的市场竞争能力和供种保障能力，从而实现甘肃省由种业大省向种业强省的良好跨越。

1 甘肃省玉米制种产业发展现状

甘肃省已发展成为全国最大的杂交玉米种子产区，特别是以河西走廊为主的玉米种子生产基地，具有地势平坦、气候干燥、降雨量少、光照充足、昼夜温差大、灌溉便利的自然优势，是“天然的种子生产车间”和“天然的仓库”，河西地区年产种量占全国玉米生产用种量的60%左右，是全国现代农作物种业三大核心基地之一。近年来，甘肃省玉米种子生产基地综合能力提高显著，种业发展迅速，所生产的玉米种子质量指标好，籽粒饱满，生活力强，千粒重、发芽率高，种子色泽鲜亮，商品性好，在市场上具有较强的竞争力。2020 年全省玉米制种面积86 400 hm2，产种5.46 亿kg，分别占全国总面积和总产量的55.6%和59.7%，保障了全国50%以上的大田玉米用种。“张掖玉米种子”已获得全国唯一的种子国家地理商标证书。甘肃省的玉米制种产业已形成规模，对全国的粮食生产起到举足轻重的作用。

农业现代化，种子是基础，“种业翻身仗”更是把种业安全、种子质量提到新高度。作为制种大省，为提升甘肃省种子质量水平，加大假劣种子监管力度，严厉打击套牌品种侵权违法，甘肃省率先在全国开展省级DNA 指纹库和国家指纹库的对接工作，并着手构建甘肃省审定玉米品种DNA 指纹图谱库和标准样品库。

通过对审定的玉米品种构建省级标准样品库，并对入库品种进行DNA 指纹图谱构建，推进品种信息多元化应用，为品种准入、验证、追溯提供基础信息。同时持续推进与国家DNA 标准样品指纹库对接，形成国家、省、市、县4 级数据共享平台，推动种业信息数据共享事业的快速发展。

通过构建省级标准样品库及标准样品DNA 指纹库，能有效解决因甘肃省玉米DNA 指纹库品种数据不全、信息不完善导致种子品种侵权生产、套牌销售的种子无法及时检测的问题。项目的实施为品种鉴定提供及时有效的种子样品，为育种家品种维权提供权威有效的技术服务，为侵权案件真实性检测缩短了检测周期。

新《种子法》颁布实施后，甘肃省的品种审定工作出现了新变化，随着试验单位的范围扩大，甘肃省每年审定通过的品种也在不断增加，单玉米而言，2015 年至2021 年甘肃省审定通过的品种分别为33个、8 个、35 个、83 个、9 个、132 个、145 个，共计445个。玉米标准样品DNA 指纹库的构建，为加强育种家的知识产权保护，调动企业的自主研发积极性，提供了数据保障和技术支持。

随着种子质量检测技术的提升，传统的常规4项（水分、发芽率、净度、纯度检测）已不能满足现阶段种子市场的需求，未审定品种冒充审定品种、套牌品种侵权违法等现象，扰乱了正常的种子市场秩序。随着种子品种增多，同质化严重，肉眼无法判断品种差异，分子检测技术就至关重要，DNA 分子片段检测，具有周期短、耗时少且灵敏度高、特异性强等优点，填补了常规DUS 测试所不能发现的性状差异，同时从基因层面判断品种差异，通过检测技术升级，实现了快速准确鉴定品种的真实性，为市场监管提供强有力判别证据。

2 甘肃省玉米品种DNA 指纹库构建情况

2.1 指纹库构建准备工作

为构建甘肃省玉米标准样品DNA 指纹库，省种子总站（农业农村部玉米种子质量监督检测中心（兰州）、甘肃省农作物种子质量监督检验测试中心）不断提升检测能力，两个“中心”分别通过了农业农村部及国家认监委、省农业农村厅的资质认定和机构考核，先后获得了检验检测机构资质认证证书（CMA），农业农村部审查认可证书、农产品质量安全检测机构考核合格证书（CATL）、农作物种子质量检验机构合格证书（CASL）。在中心技术人员的共同努力下，中心每年一次性通过农业农村部科技发展中心、全国农技中心等单位组织的转基因、品种真实性和种子常规项目的能力验证检测工作并取得优秀等次。中心为实现建库需求，在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测种子真实性的基础上，购置高通量PCR 仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、ABI3500 基因测序仪和自动化工作站等多台（套）高端进口仪器设备，具备了建设DNA 标准指纹库的硬性条件；同时多次派遣具有分子生物学背景的专业技术人员前往全国农技中心、北京农林科学院等单位进行真实性检测、DNA 指纹图谱建库、SSR 检测方法探究等相关培训；中心还得到上级主管部门的大力支持，在2016 年联合国家相关单位成功对接国家标准样品DNA 指纹库，成为全国首家与国家指纹库对接的省级检测平台，真正做到省检测中心检测的样品和国家数据库内的样品无差异对接，实现了分子检测数据共享的跨越式发展。指纹库对接后，甘肃省的DNA 指纹在中心检测完成后就能同步与国家指纹库比对，大大提高了甘肃省玉米种子的检测效率和检测能力，实现了检验检测技术的新突破。

2.2 指纹库构建现状

甘肃省的指纹库样品要具有本地代表性，同时确保样品是来源可靠的亲本家种子。自2015 年中心平台搭建完善后，检测中心与农作物评审委员会联合实施，将每年甘肃省审定通过的玉米品种标准样品进行DNA 指纹库建库工作。检测中心使用SSR 分子标记技术开展指纹库构建工作。SSR 即简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也称微卫星DNA，是目前最常用的微卫星标记技术。玉米品种的鉴别分析就是通过不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA 中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可以通过PCR 扩增及电泳进行片段大小测定进行检测的原理实现的。由于SSR 重复数目变化较大，所以通过SSR 分子标记可以实现较高的多态性。依据现阶段的种子检测主要方法及相关标准——《玉米品种鉴定技术规程 SSR 标记法》（NT/T 1432-2014），选用一套（40 对）多态性高的SSR 引物进行指纹库构建工作。

检测中心通过标准样品收集、样品登记及编制溯源信息、样品预处理、样品粉碎、DNA 提取、DNA 浓度测定、PCR 体系配置、PCR 扩增、毛细管电泳、数据分析、校验核对、数据上传等环节完成建库工作。其中每一个样品均通过2～3 组平行试验，40 对核心引物扩增，最终筛选出最优条带，形成40 个指纹图谱并上传至指纹图谱库。近年来，正是通过大量实验、数据分析及人员比对，逐步构建完善了甘肃省玉米标准样品DNA 指纹库。

随着甘肃省玉米标准样品DNA 指纹库建设工作的深入，参与建库的检验人员已可以通过图谱峰值及图谱形态，分析出玉米品种的特异性及甘肃省审定品种的图谱特点，为下一步开展大规模的建库及其他作物的建库工作积累了丰富的经验。

3 指纹库构建展望

建库至今，甘肃省已将2015 至2020 年审定通过的300 个品种悉数入库，形成12 000 余份数据图谱，无论是品种数量还是数据完整性，都位于全国前列。甘肃省玉米标准样品DNA 指纹库的建成，极大提升了甘肃省种子质量检测队伍的检测能力，调动了育种家的育种积极性，震慑了造假套牌行为的发生，确保了农民的用种安全，进一步保障了国家的粮食安全。

目前中心的人员配置及建成的转基因检测平台，真实性检测平台，均在全国处于领先地位。其中尤为突出的是2018 年中心顺利通过农业农村部的甘肃省农作物品种登记认证检测分中心建设项目。该项目通过使用LGC 平台，SNP 的技术手段开展品种登记认证工作。SNP 的检测手段是目前种子检测领域最先进的技术方式，会在现有SSR 的技术上，大大提高检测通量和检测能力，缩短检测时间，提高检测效率。甘肃省作为全国第一批省级农作物品种登记认证检测分中心，是国内最早验收并投入使用的检测平台，现已开展相关图谱验证工作。2020 年以来，中心通过SNP 平台有效参与国家重点研发计划“七大农作物育种”重点专项“主要农作物种子分子指纹检测技术研究与应用”项目验证工作，完成SNP验证试验198 份，标记位点18 045 个。随着审定品种的增多、技术手段的提升和检验人员技术的提高，甘肃省的标准样品指纹库将会不断完善，省级检测中心将通过提升自身检测水平，开展基层检验员培训、助力市州一级检测中心技术提升，其中临泽县建成的张掖国家级玉米种子生产基地种子质量监督检验中心已成为玉米种子检测项目全覆盖的检测机构，2017年该中心成功对接国家玉米DNA 指纹库，成为我国唯一一家县级对接成功的检测机构。同时，中心也将引导有分子检测能力的基层检测中心积极扩展分子检测项目等，为提高种子市场监管水平，打击套牌侵权品种的生产销售，促进种子生产，促使经营者增强质量意识；科学研究和产业化开发提供技术支撑和服务，为推进我国非主要农作物品种更新和市场监管，确保品种的真实性和生态的适应性提供保障；提高农产品产量和品质，提高市场竞争力，增加农民收入；提升种业自主创新能力、知识产权保护能力、企业的市场竞争能力，为国家种业安全提供技术保障。