基于TGF-β/Smad7信号通路探讨针灸对大鼠溃疡性结肠炎的影响※

曾于恒 林丽珠 吴小云 吴 锋

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)为非特异炎性肠病，以腹泻、便次增多、黏液脓血便等为主要症状。至目前为止，其病因和发病机理尚未完全阐明[1]，由于其病变范围能累及全部肠黏膜，并且病情易反复，迁延难愈，世界卫生组织将其归为难治性疾病，一般认为胃肠道免疫功能的紊乱是其主要病因[2]。流行病学调查[3]显示，近年来该病在亚洲的发病率明显升高。相关研究[4]表明，TGF-β为多效性细胞因子，具有抗炎活性，TGF-β 的活化与受体结合，TGF-β/Smad7信号通过通路调节黏膜免疫作用，促使组织的修复，是治疗UC 的关键靶标。多项研究表明[5-8]，针灸能有效治疗UC，本研究通过观察针灸对UC 的疗效，并从黏膜组织基于TGF-β/Smad信号通路方面研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组斯莱克景达公司（湖南省长沙市）提供的40 只SPF 级SD 雄性大鼠（体重：180～200 g），质量合格证号为43004700032111，许可证号为SCXK（湘）2014-0002。动物饲养于该公司SPF 级实验室，温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，适应性饲养1 w后，按随机分组法，将其分成空白组、模型组、电针组、隔药灸组各10只。

1.2 实验用药及器材TNBS（SLBG2766W）；乙醇（国药集团，批号：20181017）；水合氯醛（国药集团，批号：20200917）；石蜡切片机（KW2148，浙江温州）；显微镜（奥林巴斯BF52）；实时荧光定量PCR仪（艾华德replex3）；PCR 扩增仪（Bio-RadT110 thermal cycler）；化学发光凝胶成像（Bio-Rad）；台式高速冷冻离心机（HERNLEZ33HK）；核酸水平电泳仪（武汉百达生物BGSUHWIDI）；核酸蛋白浓度测定仪(BioDropBD1106)；Elisa 试剂盒（重庆基因美生物，批号：E-EL-R0016c、E-AB-16094、E-AB-12904）。

1.3 模型制备禁食、不禁水2 d，空白组予0.6 mL生理盐水灌肠；其余三组于腹腔用10%的水合氯醛350 mg/kg 进行注射麻醉，用灌胃针取0.6 mLTNBS-50%乙醇造模剂注入肛门8 cm。灌肠后提尾倒置30 s，然后归笼，取头低脚高位。模型制备后第2 d，每组随机选取3 只大鼠，观察耸毛、拱背、进食和活动等情况，并处死大鼠取结肠组织，观察结肠病理变化来判定UC模型是否成功[9]。

1.4 干预方法空白组、模型组：无干预。

电针组：造模成功后，将大鼠固定在特制的鼠架上，暴露腹部，根据《实验针灸学》[10]选取天枢（双侧）、气海等穴位（见图1），天枢穴予毫针刺入13 mm，气海穴予毫针刺入7～10 mm，接G6805ll 型电针仪，选择疏密波，20 min/次，每日1次，共14 d。

图1 大鼠气海、天枢（双侧）解剖示意图

隔药灸组：造模成功后，将肉桂5 g、附子5 g 研末，用黄酒混合调制，并用模具做成厚度约0.2 cm、直径约1 cm的药饼，中间用针刺小孔，将药饼置于大鼠的气海穴、天枢穴（双侧），并选择清艾条内的艾绒制成重约1 g、底面直径约1 cm 的圆锥形艾炷，隔药饼灸，每次灸1壮，每日1次，共14 d。

1.5 标本采集干预结束后禁食、不禁水1d，麻醉后解剖腹主动脉，抽取动脉血5 mL，用于ELISA 检测；取3 cm结肠，剖开，分成2段，1段用于RT-PCR检测，1段用于HE染色。

1.6 观察指标

1.6.1 一般情况 整个实验过程，每日观察并记录大鼠精神、活动、体重、饮食、毛色、排便等情况。

1.6.2 大鼠疾病活动性指数（DAI）评分 参考Mur⁃thy 标准[11]，DAI 评分为干预后大鼠体重下降率、大便性状、便血程度这3个指标评分的均值。见表1。

表1 大鼠疾病活动性指数（DAI）评分细则

1.6.3 结肠黏膜损伤指数（CMDI）评分 根据结肠黏膜的病理改变情况来进行评分。0分为结肠黏膜无损伤；1 分为结肠黏膜轻度水肿，无溃疡；2 分为结肠黏膜充血且粗糙呈颗粒状；3 分为结肠黏膜形成<1 cm的溃疡；4分为结肠黏膜溃疡1～2 cm，但和外周脏器没有粘连；5分为结肠黏膜溃疡1～2 cm，肠管增厚，且肠管和周围脏器粘连严重。

1.6.4 病理学观察 取各组大鼠结肠组织，经石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红（HE）染色，结肠组织通过显微镜下观察病理学改变。

1.6.5 血清TGF-β、Smad7及IL-10表达量 将结肠黏膜置于玻璃匀浆器中，加入PBS 匀浆，离心15 min，取上清液，采用ELISA法，检测各孔的吸光度值，计算TGF-β、Smad7及IL-10表达量。

1.6.6 结肠组织 TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表达量 采用RT-PCR 法检测。步骤：取100 mg 组织于EP 管，加1 mL Trizol 匀浆、200 μL 三氯甲烷，离心，取500 μL上清液于新EP管，加500 μL异丙醇，离心15 min，弃上清液，取RNA 沉淀干燥至透明状，加150 μL RNase，溶解，混匀，取2 μL用于测定RNA浓度、质量。当OD260/OD280为1.8～2.0时质量较好，取2 μL 进行逆转录，合成cDNA，用Realtime PCR 检测。PCR 扩增：95 ℃预变性2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 次循环，凝胶成像仪检测质量。用2-△△Ct方法计算TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA 表达量。基因TGF-β、Smad7、IL-10 的引物序列见表2。

表2 基因TGF-β、Smad7、IL-10引物序列

1.7 数据统计方法采用SPSS 20.0 进行统计，各组数据均以()表示，多组间数据经方差齐性检验后，采用单因素方差分析进行两组间比较，检验水平α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模后，空白组大鼠神情自然，灵活度好，肛周毛发干净，进食、二便无异常；各模型组大鼠都有耸毛、拱背、进食减少、活动减少甚至不动，伴有稀便。结合病理结果，判定UC造模成功[9]。

2.1 各组大鼠DAI及CMDI评分比较空白组大鼠

DAI、CMDI评分显著低于其他三组（P<0.05）；电针组、隔药灸组大鼠DAI、CMDI评分均明显低于模型组（P<0.05）；电针组、隔药灸大鼠DAI、CMDI评分比较，无统计学差异（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠DAI、CMDI评分比较（分，）

表3 各组大鼠DAI、CMDI评分比较（分，）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 光镜下各组大鼠的结肠病理组织比较空白组大鼠结肠黏膜结构完整，无炎性细胞浸润、充血；模型组大鼠结肠黏膜结构较模糊，排列紊乱，腺体结构较不完整，大量炎性细胞浸润，并坏死、出血；电针组和隔药灸组大鼠结肠黏膜结构相对较完整，明显黏膜病变减少，腺体排列较连续，少量炎性细胞浸润。见图2。

图2 光镜下各组大鼠的结肠病理组织（10×10）

2.3 各组大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA表达量比较模型组、电针组、隔药灸组大鼠TGF-β mRNA、Smad7 mRNA 及IL-10 mRNA 表达量显著高于空白组（P<0.05），电针组、隔药灸组低于模型组（P<0.05）。见表4。

表4 各组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表达量比较（）

表4 各组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA及IL-10 mRNA表达量比较（）

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.4 各组大鼠血清TGF-β、Smad7 及IL-10 表达量比较与空白组比较，其他三组TGF-β、Smad7及IL-10表达量升高；与模型组比较，电针组、隔药灸组TGFβ、Smad7及IL-10表达量降低（P<0.05）。见表5。

表5 各组大鼠血清TGF-β、Smad7及IL-10表达量比较（-x±s）

3 讨论

根据UC的临床症状及体征，当归属于中医学“泄泻”“久痢”范畴。《证治汇补》曰：“泄者，大便溏薄；泻者，大便直下，略分轻重，总属脾虚。”可见，UC的发病根本乃脾胃虚弱[12-14]。刘欢等[15]认为，脾虚不运贯穿于UC疾病过程的各个阶段。脾胃虚弱最终可发展为脾肾阳虚，导致清阳下陷，从而使魄门失主，泻下无度，发为久泻，正如《景岳全书》所言：“脾弱者，因虚易泻，因泻愈虚，盖关门不固，则气随泻去，气去则阳衰，阳衰则寒从中生……阴寒性降，下必及肾……所以久泻不愈，必自太阴传于少阴而为肠澼。”因此，UC病位在肠，与脾、肾关系密切。综合其病因病机，治疗当以温补脾肾、通调肠腑为法。

天枢穴归足阳明胃经，乃阳明脉气所发之处，且其为大肠经募穴，参考腑病取募的取穴原则，天枢穴不仅可以有效通调大肠腑气、降浊化湿，而且还有益胃健脾、强身止泻作用。《素问·六微旨大论》云：“天枢之上，天气主之；天枢之下，地气主之。”说明此穴为升清降浊的穴位，可通调脏腑。《千金要方》记载：“大便泄数，并灸天枢。”《针灸大全》曰“泄泻不止，里急后重……天枢二穴。”《针灸大成》描述天枢主“主奔豚，泄泻……水痢不止，食不下，水肿腹胀肠鸣……冬月感寒泄痢”。气海穴乃全身气血汇集之所，可生发元气、培元益肾、扶正固本、益气温阳。《千金翼方》曰“水泄痢，灸气海百壮，三报之”“胀满瘕聚滞下疼冷，灸气海百壮”。天枢、气海相配，可以达到温养脾肾、通调气血、调和阴阳之功效。

电针是将电与针两种刺激方式相结合而防治疾病的一种方法，可以代替人做较长时间的持续运针，且能较客观地控制刺激量。相关研究[16]表明，电针具有促进血液新陈代谢、止痛、调理人体生理机能等作用。对于本研究中电针治疗时所选择的疏密波，李晓璐等[17]认为，该波形具有增强人体代谢、促进血液循环、有效改善组织营养、抗炎、消除水肿等功效。

隔药灸是将中药及艾灸的优势高度结合的一种灸法。本研究中，药饼的组成为附子、肉桂，二者皆大热，味辛，归脾、肾经，善补火助阳，相须为用则功效益彰，可健脾温肾以治其本。其中，附子为补助元阳之要药，具有温补肾阳、回阳救逆之功，《本草正义》曰：“附子辛温大热，性善走，故为通行十二经纯阳之要药。”肉桂具有温经通脉、引火归元、补火助阳之功效，乃治疗命门火衰之要药，《本草求真》曰其“大补命门相火，益阳治阴”。该法集穴、药、灸作用于一体，药物、艾灸对穴位可起到双重刺激作用。

本研究结果发现，空白组上皮结肠黏膜完整，未见充血、水肿，具有完整的腺体性结构，未见炎性细胞浸润；而模型组结肠黏膜破损，伴充血，腺体排列紊乱，炎性细胞大量浸润；电针组、隔药灸组上皮结肠黏膜组织损伤有不同程度修复，腺体量增多，排列较整齐，炎性细胞明显下降，表明电针及隔药灸均能促进黏膜修复且有效抑制炎症反应。

相关研究[18]表明，在免疫缺陷、易感性基因及环境等多方面因素综合作用下，人体分泌过多的炎症介质及炎症因子，导致大肠黏膜受损，发为UC。发病时，黏膜通透性升高，肠内物质通过黏膜固有层进入，激活免疫，导致炎症。课题组前期研究发现[19]，UC 的发病机制可能与NOXs 信号通路途径有关，大量ROS活化产生，使NLRP3 小体激活，导致促炎因子大量分泌，而电针及隔药灸治疗溃疡性结肠炎可抑制NOXs-ROS-NLRP3 炎症小体信号通路，从而发挥作用。TGF-β因子可有效抑制肠道炎症性反应，诱导免疫耐受性，恢复受损组织，因而可通过TGF-β 信号通路途径来治疗炎症性肠病[20]。在此通路依赖Smad 途径，p-Smad2 与p-Smad3 结合，并与Smad4 产生复合物质，进入细胞核，靶基因进行调节转录[21]。研究显示[22]，UC肠内炎症性特征由p-Smad2/3表达量降低和TGF-β信号传导性受损以及Smad7（磷酸化抑制剂）、IL-10 表达升高所引起[23]。本实验发现，模型组大鼠结肠组织TGF-β mRNA、Smad7 mRNA、IL-10 mRNA及血清中TGF-β、Smad7 及IL-10 的表达量均明显高于空白组，电针及隔药灸干预后，这些指标均较模型组明显降低，表明电针及隔药灸可能通过TGF-β/Smad7信号通路抑制炎症性反应，促进黏膜修复。

综上所述，电针及隔药灸可促使UC 大鼠结肠黏膜损伤修复，抑制炎症性反应，其作用机制可能与TGF-β/Smad7 信号通路有关。电针及隔药灸如何调控TGF-β/Smad7 信号通路发挥其治疗作用有待今后进一步研究。