罕见IVS Ⅱ-705(T>G) β-地中海贫血基因携带者2例报道并文献复习*

黄心怡,林 靖

1.成都中医药大学医学与生命科学学院，四川成都 611137；2.贵州省人民医院输血科，贵州贵阳 550002

β-地中海贫血(简称β-地贫)是我国南方地区常见的一种遗传性溶血性贫血病，临床表现为小细胞低色素性贫血。β-地贫是由于β-珠蛋白(HBB)基因突变导致β-珠蛋白肽链缺如(β0)或合成不足(β+)引起的常染色体隐性遗传病[1-2]。到目前为止，在人类血红蛋白(Hb)变异和地中海贫血数据库(HbVar：https://globin.bx.psu.edu/)中收录的β-地贫突变类型有300多种。不同地域和人群之间的β-地贫基因突变谱存在较大差异。目前在中国人群中已发现129种HBB基因点突变(含异常Hb)和16种β-地贫缺失突变。其中8种突变(c.124_127delTTCT、c.52A>T、c.316-197C>T、c.-78A>G、c.216_217insA、c.79G>A、c.92+1G>T、c.-79A>G)占中国人β-地贫突变总体的95%以上[3]。随着测序技术在临床上的广泛运用，一些罕见突变类型也不断被发现，为临床遗传咨询和产前诊断提供了更多的依据[4-5]。本研究发现了2例罕见IVS Ⅱ-705(T>G) β-地贫携带者，现对其临床表型及基因型进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 2例患儿之间无血缘关系，患儿1为女性，年龄10个月；患儿2为男性，2岁。患儿在贵州省人民医院血常规检测时发现有小细胞低色素贫血表现，Hb电泳发现HbA2升高，需进一步做β-地贫基因检测。经家属知情同意后抽取乙二胺四乙酸二钾抗凝外周静脉血2 mL。

1.2主要仪器与试剂 Sysmex XN-9000全自动血细胞分析仪及配套试剂；法国Sebia毛细管电泳仪及配套试剂；天隆NP968核酸自动提取仪，E-Cycler TM 96 PCR扩增仪；β-地贫基因突变检测试剂盒由凯普生物科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1血液学检测 在仪器最佳状态下检测标本，严格按照操作程序检测红细胞计数(RBC)、Hb水平、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度的标准差(RDW-SD)等红细胞参数。采用Sebia毛细管电泳仪检测HbA、HbA2、HbF等Hb成分的相对水平。

1.3.2β-地贫基因检测 采用PCR结合反向点杂交(RBD-PCR)技术[6]，检测17种HBB基因点突变，依次为CD41-42(-TCTT)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD17(A>T)、-28(A>G)、CD26(G>A)、CD71-72(+A)、CD43(G>T)、-29(A>G)、Int(T>G)、CD14-15(+G)、CD27-28(+C)、-32(C>A)、-30(T>C)、IVS-Ⅰ-1(G>T)、IVS-Ⅰ-5(G>C)、CD31(-C)、CAP +40-+43(-AAAC)。对罕见β-地贫基因突变类型，应用PCR技术扩增HBB基因全长，引物序列为F：5′-ACGGCTGTCATCACTTAGAC-3′，R：5′-CTCCCACATTCCCTTTTTAG-3′。扩增产物送至上海生物工程有限公司进行双向测序，测序结果与GeneBank上的HBB基因参考序列进行比对分析测，查找是否存在其他罕见突变类型。

2 结 果

2.1血液学检测结果 2例患儿的血液学检测结果均为轻度小细胞低色素贫血，MCV、MCH降低，血红蛋白电泳HbA2水平升高，HbF水平轻度升高，提示为轻型β-地贫(携带者)。见表1。

表1 2例患儿的血液学表型结果

2.2基因检测结果 2例患儿均未检出17种中国人群常见的β-地贫基因突变类型。经HBB基因序列分析，发现2例患儿均为HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)杂合突变，国际命名法(HGVS name)为HBB:c.316-146T>G。该突变为HBB基因第二个内含子的705号碱基T突变为G，为致病性突变，临床表型为β+。见图1。IVS Ⅱ-705(T>G)突变形成的异常HBB基因mRNA剪接体见图2。

注：A、B分别为患儿1、患儿2的HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)杂合突变(箭头所示为突变基因位点)。图1 2例患儿HBB基因测序结果

注：标识508的箭头为IVS Ⅱ-508位点，潜在的3′剪接受体；标识705的箭头为IVS Ⅱ-705(T>G)突变位点，产生5′剪接位点。图2 IVS Ⅱ-705(T>G)突变引起异常剪接示意图

3 讨 论

β-地贫是一种遗传异质性较大的溶血性贫血病，已发现的HBB基因突变类型有800多种，其中致病性突变有300多种。不同地域和人群的β-地贫基因突变谱存在较大差异。尽管我国南方地区常见β-地贫基因突变类型基本一致，但不同地区最常见的突变类型有所不同，如广东、广西以CD41-42(-TCTT)最为常见，福建、江西以IVS-Ⅱ-654(C>T)最为常见，贵州、重庆以CD17(A>T)最为常见，云南以CD26(G>A)最为常见[7]。目前国内临床实验室常用β-地贫基因检测方法可检出中国人群常见的17种突变类型，但不能检测到罕见的突变类型，在临床应用上具有一定的局限性。

本研究中的2例患儿均表现为轻度小细胞低色素性贫血，且Hb电泳HbA2升高，为典型的轻型β-地贫表型。采用常用的β-地贫基因检测方法未检测出中国人群常见的17种突变类型，考虑可能存在罕见β-地贫基因类型。采用Sanger测序发现2例患儿均为HBB基因IVS Ⅱ-705(T>G)杂合携带者。在HbVar数据库的收录信息显示为致病性突变，临床表型为β+。2例患儿的基因型与表型一致，诊断轻型β-地贫明确。

IVS Ⅱ-705(T>G)是一种非常罕见的β-地贫基因突变类型，最早是由美国学者MAQUAT等[8]于1980年报道。随后，DOBKIN等[9]研究发现，IVS Ⅱ-705(T>G)突变导致了在HBB基因IVS Ⅱ内产生了一个新的功能性的5′剪接位点GAG GTA AGA，与IVS Ⅱ正常的3′剪接受体之间产前一个潜在的剪接体。同时，IVS Ⅱ-705(T>G)突变还激活了IVSⅡ第508位潜在的3′剪接受体，与IVS Ⅱ正常的5′剪接供体之间产前异常剪接。因此，IVS Ⅱ-705(T>G)突变阻止了IVS Ⅱ正常的5′剪接位点与3′剪接受体之间的剪接，从而形成异常的HBB基因mRNA剪接体(图2)。

国内外对IVS Ⅱ-705(T>G)突变位点的报道很少。国内仅JIANG等[10]在广东的一个家系中发现2例IVS Ⅱ-705(T>G)杂合携带者，红细胞参数均表现为MCV、MCH降低，HbA2升高，其中1例有轻度贫血。MURAD等[11]在一个叙利亚家系中发现2例IVS-Ⅰ-1(G>A)/IVS-Ⅱ-705(T>G)复合杂合患者，临床表现为重型β-地贫，Hb分别为46 g/L和52 g/L。本研究发现的2例IVS Ⅱ-705(T>G)杂合携带者均表现为轻度小细胞低色素贫血。因此，IVS Ⅱ-705(T>G)突变携带者临床上表现为轻型β-地贫，多数有轻度贫血。当IVS Ⅱ-705(T>G)突变合并有其他β-地贫基因突变位点时，可表现为重型或中间型β-地贫。其他人群中尚未见该突变位点报道。本研究在贵州地区发现较罕见的IVS Ⅱ-705(T>G)突变。

IVS Ⅱ-705(T>G)突变位点不在常规实验室β-地贫基因突变检测的位点范围内，容易造成漏诊。为提高β-地贫基因突变检测的灵敏度，需要结合患者的血液学表型和基因型进行综合分析。经血液学表型检查提示为β-地贫，但常规方法检测为阴性的样本，需要进一步采用Sange测序和MLPA技术等二线技术检测罕见的HBB基因点突变和大片段缺失突变。此外，有条件的实验室也可采用二代测序(NGS)技术直接检测β-地贫基因突变。有研究报道NGS可将地中海贫血高风险夫妇基因突变的检出率提高到23.2%[12-13]。尽管NGS检测β-地贫基因的灵敏度很高，尤其是提高了罕见突变类型的检测率，但仍存在一些不能检出的位点。由于检测过程中还存在其他影响因素，任何一种检测方法均存在假阴性的可能。因此，临床上仍然要重视β-地贫表型分析，当表型与基因型不一致时，需要重新检测或采用多种方法联合检测以避免假阴性的发生。