RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平变化及相关性研究*

桂冬梅，尹杨艳，陈丹丹，蔡昌君

海南医学院第一附属医院儿科，海南海口 570102

呼吸窘迫综合征(RDS)属于肺功能不全类疾病，多见于早产、剖宫产、有窒息史的新生儿，发病时间多在出生后不久[1]。临床研究指出，多种细胞因子在肺泡氧化应激代偿障碍、炎症损伤等过程中发挥作用，共同推进RDS的发生、发展[2]。研究表明，睾素2(SPOCK2)是睾丸细胞外软骨素和硫酸乙酰肝素蛋白多糖的成员，与早产儿肺损伤发生有关[3]。抵抗素样分子β(RELM-β)是一种在肺组织、血液等组织中表达的蛋白，在多种呼吸道疾病中起调节肺纤维化进程，发挥炎症效应等作用，目前，关于RELM-β参与早产儿RDS的发生、进展的研究少见[4]。还有研究显示，微小RNA-21(miR-21)的高表达与多种肺部疾病相关，在中，miR-21表达与炎症反应进程密切相关[5]。目前临床关于RDS早产儿血清SPOCK2、RELM-β、miR-21水平及三者相关性的研究少见，故对此展开研究，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2020年1月在本院住院的50例RDS早产儿作为研究组，另选取同期于本院产科出生的50例健康早产儿作为对照组。纳入标准：(1)符合《实用新生儿学》中新生儿RDS诊断标准[6]，且胎龄<35周；(2)出生12 h内出现发绀、呻吟、吸气三凹征和呼吸急促，并呈进行性加重；(3)吸室内空气时经皮血氧饱和度<85%，动脉血气分析血氧分压<50 mm Hg，出现中央性发绀，需吸氧才能维持动脉血气分析血氧分压>50 mm Hg；(4)胸部X线检查显示有磨玻璃样改变和支气管充气征。排除标准：(1)身体畸形早产儿；(2)先天性疾病早产儿；(3)母亲有吸烟史早产儿；(4)肺部感染或其他呼吸系统疾病早产儿；(5)全身重要脏器功能不全早产儿；(6)有哮喘、鼻炎家族史早产儿。两组胎龄、性别、体质量、分娩方式、母亲患妊娠期糖尿病和产前使用糖皮质激素情况比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性；研究组新生儿窒息发生率(54.00%)高于对照组(28.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试早产儿家长均知情并签署同意书。

表1 两组基线资料比较

组别n分娩方式[n(%)]剖宫产自然分娩母亲患妊娠期糖尿病[n(%)]产前使用糖皮质激素[n(%)]研究组5026(52.00)24(48.00)26(52.00)10(20.00)对照组5019(38.00)31(62.00)19(38.00) 8(16.00)χ2/t1.9802.5970.271P0.1590.1070.603

1.2指标检测

1.2.1病情分度[7]RDS早产儿均行胸部X线检查，依据胸部X线片表现分级：Ⅰ级，两肺野透亮度明显降低，可见网状影，均匀散在的细小颗粒；Ⅱ级，相较于Ⅰ级病变严重，可见支气管充气征延伸至肺野中外带；Ⅲ级：病变明显加重，支气管充气征明显，心缘、膈面模糊。Ⅳ级：肺野呈白肺，支气管充气征呈现似秃叶树枝状，心肺界消失。根据胸部X线片分级判断患儿病情严重程度，Ⅰ～Ⅱ级为轻度组(20例)，Ⅲ～Ⅳ级为中重度组(30例)。

1.2.2标本采集 于清晨采集所有受试早产儿空腹静脉血6 mL，分装于两管。一管4 mL(不抗凝)，以转速3 000 r/min、离心半径5 cm离心10 min，分离血清；另一管2 mL(抗凝)，以同样参数离心分离血浆。将分离后获得的血清、血浆均置于-80 ℃冰箱保存待检。

1.2.3SPOCK2、RELM-β水平检测 于-80 ℃冰箱中取出待检标本，采用酶联免疫吸附试验检测血清RELM-β、血浆SPOCK2水平，试剂盒均购自上海裕平生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4miR-21水平检测 取适量血清标本于EP管中，应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-21水平。按照miRNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书操作步骤，提取总miRNA，以此为模板，按照cDNA合成试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书操作步骤，进行反转录合成cDNA，反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min。以U6为内参，miR-21上游引物为5′-TCGGCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物为5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用Rcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(天根生化科技有限公司)，在qPCR仪上进行扩增反应，反应条件：变性95 ℃ 30 s；退火60 ℃ 20 s；延伸72 ℃ 10s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达水平。

1.2.5随访 研究组治疗出院后，进行为期6个月的随访，电话联系患儿家属，对患儿进行体格检查，评估患儿神经发育状况，依据患儿神经发育有无损伤，分为预后良好组(38例)和预后不良组(12例)。

1.2.6观察指标 记录并比较各组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析研究组SPOCK2、RELM-β、miR-21间的相关性，比较不同病情严重程度、预后、临床病理特征RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平，分析SPOCK2、RELM-β、miR-21单独和联合检测对早产儿RDS的诊断价值。

2 结 果

2.1研究组与对照组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较 研究组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 研究组与对照组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较

2.2研究组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，SPOCK2水平与RELM-β、miR-21均呈正相关(r=0.459、0.552，P<0.05)，RELM-β水平与miR-21呈正相关(r=0.489，P<0.05)，见图1。

注：A为SPOCK2水平与RELM-β间关系散点图；B为SPOCK2水平与miR-21间关系散点图；C为RELM-β水平与miR-21间关系散点图。图1 SPOCK2、RELM-β、miR-21间关系散点图

2.3不同病情严重程度RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较 中重度组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同病情严重程度RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较

2.4不同预后RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较 预后不良组SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于预后良好组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同预后RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较

2.5不同临床病理特征RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较 母亲是否患妊娠期糖尿病、是否患妊娠期高血压、是否双胎或多胎、是否胎膜早破的RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；新生儿窒息、母亲产前未使用糖皮质激素的RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平高于无新生儿窒息、母亲产前使用糖皮质激素的RDS早产儿，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同临床病理特征RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较

续表4 不同临床病理特征RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平比较

2.6SPOCK2、RELM-β、miR-21单独和联合检测对早产儿RDS的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，SPOCK2、RELM-β、miR-21联合检测诊断早产儿RDS的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度、准确度分别为0.952、90.0%、92.0%、91.0%，高于SPOCK2、RELM-β、miR-21单独检测的AUC(0.792、0.695、0.730)、灵敏度(78.0%、76.0%、72.0%)、特异度(76.0%、75.0%、76.0%)、准确度(77.0%、75.0%、76.0%)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 SPOCK2、RELM-β、miR-21单独和联合检测对早产儿RDS的诊断价值

图2 SPOCK2、RELM-β、miR-21单独和联合检测诊断早产儿RDS的ROC曲线

3 讨 论

RDS是由于早产儿肺发育尚未成熟，各系统功能均不完善，以及肺表面活性物质缺乏或失活所导致的呼吸障碍性疾病，具有较高的病死率。RDS早产儿易发生代谢性酸中毒、炎性因子浸润，治疗难度较大。目前多采用保护性机械通气等方式治疗，可降低RDS早产儿的病死率，然而其效果不太理想。因此，寻找早期诊断早产儿RDS和评估病情严重程度的指标有着重要的临床价值[8-9]。

SPOCK2是骨黏连蛋白家族的细胞外基质钙黏连蛋白，可能作用于细胞外蛋白酶级联的调节[10]。有研究表明，SPOCK2与基质金属蛋白酶(MMP)相互作用，在肺发育中起关键作用[11]。陈涛等[12]研究结果显示，SPOCK2可能参与肺发育过程，在高氧刺激时对肺组织起保护作用，SPOCK2的表达模式可能与肺发育不成熟密切相关。本研究结果显示，研究组SPOCK2水平高于对照组，且中度组高于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明SPOCK2水平可以反映患儿的疾病状态。MMP-14和MMP-16可抑制pro-MMP-2活化，而SPOCK2则通过NH2末端结构域与SPOCK3的羧基(COOH)末端结构域结合，消除MMP-14和MMP-16的抑制作用，从而使得MMP-2激活，最终促进细胞外基质的降解和细胞的迁移、侵袭[13]。

RELM-β最早在结肠被发现，后来被证实在肺等组织中也有表达，RELM-β作为促有丝分裂因子，刺激气道上皮细胞增殖，促进多种转化介质的产生，参与肺血管重塑[14]。马艳英等[15]研究结果显示，非小细胞肺癌患者RELM-β水平升高，且与非小细胞肺癌病理分期呈正相关，可通过检测RELM-β水平对非小细胞肺癌进行诊断及病理分期评估。上述结果提示RELM-β与肺部疾病具有一定的联系。本研究结果显示，研究组RELM-β水平较对照组高(P<0.05)，且随着RDS早产儿病情严重程度加重，其水平也逐渐升高(P<0.05)。RELM-β具有Th2细胞因子依赖性，可刺激肺血管内皮细胞及平滑肌细胞增殖，促进胶原沉积和参与炎症反应，从而促进微血管新生，调节毛细血管通透性，改善肺泡氧合，修复肺损伤，改善停滞的肺发育，当病情进展，肺损伤加重时，机体或选择进一步增加RELM-β的分泌来代偿加重的肺损伤[16-17]。

miR-21在心血管系统、呼吸系统等多种疾病中均发挥作用，临床上对早产儿RDS的治疗包括抑制B细胞的增殖[18]。本研究结果显示，miR-21水平在RDS早产儿中呈高表达(P<0.05)，且随着患儿病情加重，其水平也逐渐升高(P<0.05)。目前对于miR-21水平升高是否促进RDS早产儿疾病进展尚不清晰。miR-21与抑癌基因PTEN的mRNA结合，抑制PTEN的表达[19]。另外有研究表明，PTEN下调可加强中性粒细胞的功能，提高免疫力，减少肺部细菌感染的发生[20]。在RDS患者中，miR-21上调可降低PTEN表达，对肺部起保护作用。同时，miR-21可逆向调控肿瘤坏死因子-α的表达，而肿瘤坏死因子-α可减少肺表面活性物质表达。所以，miR-21可通过增加肺表面活性物质、增强中性粒细胞功能，进而在RDS中发挥作用[21]。

Pearson相关分析结果显示，SPOCK2、RELM-β、miR-21互为正相关(P<0.05)；单因素分析结果显示，新生儿窒息、母亲产前未应用糖皮质激素的RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平更高(P<0.05)。可能因为窒息在一定程度上损伤了肺泡上皮细胞，抑制了肺表面活性物质的合成及活性，以致发生RDS。ROC曲线分析结果显示，SPOCK2、RELM-β、miR-21单独检测对早产儿RDS均有一定诊断价值，而这3项指标联合检测诊断早产儿RDS的效能要优于单独检测的诊断效能，提示检测患儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平可能有助于RDS的诊断。本研究仍存在不足之处，如纳入样本量较少，结果可能受偏倚影响，需增大样本量，获取更为准确的数据，进一步证实本研究。

综上所述，RDS早产儿SPOCK2、RELM-β、miR-21水平升高且相互呈正相关，3项指标联合检测对早产儿RDS的诊断价值较高。