SMA 模型小鼠骨髓间充质干细胞体外培养体系的建立

陈志衡,吴刘成,景谨,朱顺星*

(1.南通大学实验动物中心,江苏 南通 226001;2.南通大学江苏省教育部神经再生重点实验室,江苏 南通 226001)

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA),一种罕见的由于脊髓前角发生退行性病变,导致运动神经元功能退化、肌肉萎缩的常染色体隐性的神经退行性遗传病[1-2],是婴儿致死率最常见的遗传性神经疾病之一,在新生儿中患病率达1/6000[2]。 目前通过修正SMN2(survival of motor neuron 2)基因[3];或增加SMN2 exon7 的列入[4];或对患者的SMN1 基因进行替代进而达到挽救SMA患者的效果[5]。 或将SMA 患者皮肤成纤维细胞或尿液分离的肾小管上皮细胞诱导成IPSC(induced pluripotent stem cells,诱导多能干细胞),进一步将IPSC 诱导分化成运动神经元细胞,进而对患者进行治疗[6-7],但是诱导产生IPSC 的过程繁琐复杂、周期长。 骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)具有贴壁生长、增殖能力强、分化程度低等优点[8-9],目前已用于人、大鼠、小鼠等相关疾病模型的研究[10],但有关SMA模型小鼠骨髓间充质干细胞的研究暂无报道。 本研究探索分离培养SMA 模型小鼠的骨髓间充质干细胞,并将其作为SMA 相关药物研发及筛选的工具细胞,为治疗SMA 疾病相关药物的研发及筛选提供一种工具细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

所使用SMA 模型鼠来源于Jackson laboratory,在南通大学实验动物中心保种扩繁【SCXK(苏)2019-0001】。 实验用SPF 级FVB. Cg-Smn1tm1HungTg(SMN2)2Hung/J 雄鼠(smn-/-SMN22tg/2tg)4 只,8 ～10 周龄,体重在28 ～ 30 g;雌鼠(smn-/-SMN22tg/2tg)8 只,8 ～ 10 周龄,体重在22 ～ 25 g,饲养于南通大学实验动物中心SPF 级屏障【SYXK(苏)2017-0045】。 饲养环境:温度(21 ± 1)℃、相对湿度(55 ±5)%,12 h/12 h 光/暗循环。 将1 雄和2 雌进行配种繁殖,自由采食、饮水,定期更换笼具、垫料,每日观察老鼠状态,孕鼠及时分笼,记录生产时间,选取刚出生4 d 的小鼠(基因型:smn-/-SMN22tg/2tg)8 只,雌雄不拘,体重在2 ～ 4 g。 实验过程中对小鼠的操作经南通大学动物伦理委员会伦理学审批(S20201203-301)。

1.1.2 主要试剂与仪器

DME/F12(Hyclone,SH20023.01),FBS(Gibco,A3160802),0.25% Trypsin-EDTA(Gibco,2185855),Anti-SMN/Gemin 1(Abcam,ab108531),Anti-integrin beta-1/CD29(Proteintech,12594-1-AP),Anti-CD44(Proteintech 15675-1-AP),Anti-CD34(Proteintech,14486-1-AP),Anti-CD45(Proteintech,20103-1-AP),Anti-β-Actin(Santa Cruz,sc-47778),Anti-α-TubuLin(Cell Signaling Technology,#3873),LipofectamineTM3000 Reagent(Thermo Fisher Scientific,L3000001),抗荧光淬灭液(含DAPI)(Beyotime,P0131),EDU检测试剂盒(Beyotime,C0071S),TUNEL 检测试剂盒(Vazyme,A112-01)。

NanoDropTM1000 Spectrophotometer ( Thermo Fisher Scientific, 0D-1000, 美 国), 荧 光 显 微 镜(OLYMPUS, BX51, 日本) 和倒置光学显微镜(OLYMPUS, CKX31SF, 日 本), MuLti 显 影 仪(Tanon,Tanon-5200,中国),电泳仪及湿转转膜系统(BIO-Rad,PowerPac Basic,美国)。

1.2 方法

1.2.1 SMA BMMSC 原代培养

取出生4 d 的SMA 小鼠尾尖,进行快速基因型鉴定,选取基因型为smn-/-SMN22tg/2tg的小鼠进行BMMSC 提取分离实验:将小鼠置于可封闭的安乐死装置中,释放CO2使其窒息而亡,于75%乙醇中浸泡,取其四肢,剥离肌肉,取股骨以及肱骨骨髓,用含10%FBS 的DME/F12 完全培养基培养,次日进行换液[11]。 倒置显微镜观察细胞形态,待其长满(70% ～ 80%)后记为P0,用0.25%胰酶消化,进行传代培养。 P3 代细胞用于后续实验。

1.2.2 SMA BMMSC 细胞鉴定

以每毫升1 × 106个将P3 代细胞接种于含有小圆玻片的六孔板中,37℃,5% CO2细胞培养箱内过夜培养。 次日,将小圆玻片固定,封闭后孵育一抗[12-13],4℃过夜;第3 天,洗去未结合的一抗,室温避光孵育荧光二抗2 h,洗去未结合的二抗,加入抗荧光淬灭液(含DAPI),封片,拍照。

1.2.3 SMA BMMSC 细胞转染

以每毫升1 × 106个将P3 代细胞接种于六孔板中,待其长至70% ～ 80%进行细胞转染实验。 设置空白对照组与实验组:实验组中加入ASO10-29(以下简称ASO,一种反义寡核苷酸)[14],37℃,5%CO2培养箱培养48 h。

1.2.4 RT-PCR 及SMN2 FL 表达分析

利 用 TRIzol 法 收 集 TotalRNA, 用NanoDropTM1000 Spectrophotometer 检测细胞Total RNA 浓度。 取1 μg Total RNA 进行逆转录反应,按Reverse Transcriptase 试剂盒说明进行RT-PCR 反应。 以此RT 产物为模板进行PCR 反应(反应条件:95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min 循环35 次;72℃,7 min)。 SMN 基因引物序列(5’-3 ’): Forward: ATAATTCCCCCACCACCTCCC;Reverse:TTGCCACATACGCCTCACATAC。

取少量PCR 产物以1%琼脂糖凝胶电泳,120 V,30 min,核酸成像系统显影拍照。 将剩下的PCR 产物中加入Dde1 限制性内切酶,37℃水浴,酶切过夜。 次日,将酶切过夜的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,110 V,60 min。 核酸成像系统显影拍照,计算SMN2 exon7 列入比率[4]。

1.2.5 Western Blot

收 集 蛋 白, 使 用 NanoDropTM1000 Spectrophotometer 检测蛋白浓度,调整上样量为30 μg。 用10% PAGE 凝胶进行蛋白电泳,转PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,4℃孵育过夜,洗去未结合的一抗,室温孵育二抗2 h,洗去未结合的二抗。用MuLti 显影仪显影,Image J 软件对结果进行定量分析。

1.2.6 细胞免疫荧光检测SMN 蛋白表达情况

将P3 代细胞接种于含有小圆玻片的12 孔板内,转染48 h 后进行细胞免疫荧光实验。 将小圆玻片固定、通透、封闭后,4℃孵育一抗过夜。 第2 天,洗去未结合的一抗,室温避光孵育二抗2 h,加入抗荧光淬灭液(含DAPI),封片,使用荧光显微镜拍照。

1.2.7 EDU 法检测SMA BMMSC 细胞增殖

按照EDU 检测试剂盒说明对转染48 h 后的P3代细胞进行细胞增殖实验。 每孔加入500 μL 10 mol/L EDU 溶液,37℃孵育2 h,洗去未反应的EDU溶液,4%多聚甲醛固定,0.5% TritonX-100 进行通透,洗去通透液,每孔加入500 μL Click 反应液,室温避光孵育30 min,洗去未反应的Click,加入抗荧光淬灭封片液(含DAPI),封片,拍照。

1.2.8 TUNEL 法检测SMA BMMSC 细胞凋亡

按照TUNEL 检测试剂盒说明对转染48 h 后的P3 代细胞进行细胞凋亡实验。 用4%多聚甲醛固定,洗去多聚甲醛溶液,加入0.5% TritonX-100 进行通透,加入1 × Equilibration Buffer 室温平衡30 min,避光加入50 μL TdT 缓冲液,37℃孵育1 h,洗去未反应的TdT,滴加抗荧光淬灭液(含DAPI),封片,使用荧光显微镜拍照。

1.3 统计学分析

每组实验重复3 次,使用GraphPad Prism 7.0软件进行画图分析和Image J 软件进行灰度分析。分组之间数据分析使用t检验,P＜ 0.05 被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SMA 小鼠BMMSC 培养体系的建立

所提取分离、纯化的SMA BMMSC 具有贴壁生长、可进行传代及可冻存等特点,细胞形态呈梭形或扁平型,传至P3 代后细胞形态稳定(见图1A)。对P3 代BMMSC 进行细胞免疫荧光鉴定实验,发现BMMSC 表面标志物CD29、CD44 分子均高表达,造血细胞表面标志物CD34、CD45 分子不表达或低表达(见图1B)。 因此,所提取分离得到的SMA 模型小鼠BMMSC 具有骨髓间充质干细胞的特征。

2.2 ASO 显著促进SMN2 exon7 列入水平及SMN 蛋白表达

通过PCR 及酶切反应结果表明:实验组与对照组相比SMN2 exon7 的列入水平显著上升,SMN2 有功能的全长基因显著增多,SMN2 exon7 列入比率由原来的46%上升至88%(n= 3,P＜ 0.05)(见图2A,图2B)。 通过Western Blot 实验结果表明:实验组与对照组相比SMN 蛋白表达量显著上调,SMN/β-Actin 比值由原来的1 上升至2.2(n= 3,P＜0.05)(见图2C,图2D)。

2.3 ASO 促进细胞核内Gemini bodies(gems)数量明显增多

通过细胞免疫荧光实验,以Anti-SMN/Gemin1标记绿色荧光,DAPI 标记蓝色荧光,α-Tubulin 标记红色荧光。 实验组与对照组相比细胞核内Gemini bodies 数量显著增多(P＜ 0.05)(见图3)。

2.4 ASO 显著促进SMA BMMSC 细胞增殖能力而不影响其凋亡

免疫荧光实验结果表明:实验组与对照组相比EDU 标记的细胞核数量显著增加(n= 5,P＜0.05)(见图4A,图4B),表明ASO 促进SMA 模型小鼠BMMSC 细胞增殖。 实验组与对照组TUNEL标记的细胞核数量没有差异,不具有统计学意义(n= 5,P＞ 0.05)(见图4C,图4D),表明ASO 不影响SMA 模型小鼠BMMSC 细胞凋亡。

3 讨论

SMA 患者的致病基因是位于5 号染色体上的运动神经元存活1 基因(survival motor neuron 1,SMN1),它发生病变导致SMA 疾病的发生[15]。SMN2 作为SMN1 的同源基因,其外显子7 的第六位碱基发生突变,使得外显子7 不能正常列入,导致编码产生的仅大约10%为有功能的SMN 全长蛋白,用来维持SMA 患者的生存[16]。 目前新生儿中该疾病缺陷基因携带者占1/40 ～ 60[17],占比较多的一类SMA 患者,存活不超过2 周岁[18]。

研发SMA 疾病相关药物对于治疗SMA 疾病至关重要,目前主要将SMA 疾病模型小鼠作为体内药物研发的载体,直接在SMA 疾病模型小鼠体内进行试验[4,19],成本高,工作繁琐。 但是构建的SMA 转基因小鼠,由于本身SMN 基因缺失,仅有2 个拷贝的SMN2,产生的SMN 蛋白极少[14],神经系统及外周神经系统功能发生异常,小鼠出生后状态逐渐变差,10 d 左右死亡[20],因此用于发病机制研究和药物筛选比较困难。

那么,探索一种疾病动物细胞模型用于研发SMA 疾病相关药物至关重要。 本研究前期曾尝试SMA 小鼠其他组织细胞进行体外培养,但由于不能传代、冻存等原因而放弃。 骨髓间充质干细胞具有贴壁生长、增殖能力强、分化程度低等优点,目前已广泛用于各种疾病的研究,特别是在一些神经退行性疾病例如帕金森[21]、阿尔兹海默症[22]等已有相关报道。 同时,骨髓间充质干细胞在大鼠[10]、小鼠[23]、猪[24]等动物以及人[25]已有相关报道。 本研究通过构建SMA 模型小鼠BMMSC 培养体系,在体外实验上对药物进行初步筛选、验证。 骨髓间充质干细胞来源于骨髓,具有间充质干细胞的特性,不属于造血干细胞[8]。 通过细胞免疫荧光实验检测其细胞表面标志物表达情况。 结果发现BMMSC 高表达骨髓间充质干细胞表面标志物CD44、CD29,并不表达或低表达造血细胞的表面标志物CD45、CD34。 本研究表明:所提取、分离、纯化的SMA 模型小鼠BMMSC 具有贴壁生长、可以传代等特点,同时具有骨髓间充质干细胞的特性。 同时所提取的BMMSC 来源于SMA 模型小鼠,这是体外最真实的模。 其本身具有SMA 疾病的特征:SMN2 exon7 列入水平以及SMN 蛋白表达均较低。 因此,可初步将其作为体外研究SMA 疾病的载体细胞。

目前已合成了一些药物如 Spinrazas[26]、Zolgensma[27]、Evrysdi[28]、Apitegromab[29]等已用于治疗SMA 疾病。 其中Spinrazas 是第一款被用于SMA 疾病治疗的药物,该药是一种反义寡核苷酸,通过侧脑室注射给药方式进行治疗[30]。 它通过与SMN2 内含子7 上的ISS(intron splicing silencer,内含子剪接沉默子)序列结合,进而使剪接沉默子不能与ISS 序列结合,使内含子7 发生正常剪接过程,从而使SMN2 exon7 正常的列入,增加有功能性SMN 全长蛋白的数量[4]。 ASO10-29 是一种反义寡核苷酸[14],与Spinrazas 相似,可作为治疗SMA 相关模型的阳性对照药物。 本研究发现经ASO10-29 治疗后SMN2 exon7 列入显著上升以及SMN 蛋白表达显著上调。 同时,通过凋亡和增殖实验发现:ASO10-29 不影响SMA 模型小鼠BMMSC 凋亡,却促进SMA 模型小鼠BMMSC 细胞增殖。 表明本研究建立的SMA BMMSC 是一种体外研究SMN2 基因功能或药物筛选的最佳工具细胞。

本研究从SMA 小鼠自体所提取、分离培养并鉴定的BMMSC,具有贴壁生长、获得简便以及可传代的优点,且ASO 能够通过上调BMMSC 细胞SMN2 FL 基 因 和SMN 蛋 白, 促 进 其 增 殖。 因 此, 该BMMSC 可用于研究SMN2 基因相关分子机制,以及药物前期大量初筛,具有广泛的临床前期应用价值。

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