布鲁氏菌外膜蛋白OMP25 诱导BALB/c 小鼠免疫反应的分析

王书利,李志强,魏淑娟,司丽芳

(1.河南科技大学动物科技学院,河南 洛阳 471003;2.商丘师范学院生物与食品学院,河南 商丘 476000)

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的细菌性人畜共患病,给许多发展中国家造成了巨大的公共卫生负担[1]。 人类通过接触受感染的动物或其产品而感染布鲁氏菌病[2]。 动物发病后主要表现为流产,而人类发病后会导致反复发热、脊柱炎、关节炎和骨髓炎等[3]。 Rev.1 是通过世界卫生组织和世界动物卫生组织认证的用于羊的疫苗株[4]。 Rev.1 为光滑型菌株,具有链霉素抗性[5]。 Rev.1 可诱导机体较强的免疫应答,保护羊免受布鲁氏菌的感染[6]。但这些疫苗也有一些缺点,如妊娠动物流产、干扰血清学诊断、通过气溶胶传播,及引起局部超敏反应等[7]。 因此,需要研制一种安全有效的疫苗。

重组亚单位疫苗是当前布鲁氏菌疫苗研发热点,该疫苗不存在毒性,不会引起感染。 外膜蛋白是布鲁氏菌保护性抗原。 OMP25 是布鲁氏菌的一种外膜蛋白,在多种布鲁氏菌属和菌株中具有高度保守性,与布鲁氏菌的肽聚糖层结合[8]。 OMP25 是布鲁氏菌毒力因子之一,可抑制TNF-α 产生,是布鲁氏菌潜在抗原[9-10]。 基于OMP25 在布鲁氏菌毒力中的意义,我们研究了羊种布鲁氏菌OMP25 作为布鲁氏菌病亚单位疫苗候选株的可行性。 由于重组蛋白亚单位疫苗的组成是已知的,且不能在宿主体内复制,免疫动物后不会致病,因此,亚单位疫苗被认为是新一代疫苗更好、更安全的选择。

本研究为了筛选布鲁氏菌亚单位疫苗株的候选抗原,对外膜蛋白OMP25 进行原核表达,并对其诱导机体产生的免疫反应进行检测,为亚单位疫苗候选抗原的筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

15 只SPF 级雌性BALB/c 小鼠,6 周龄,体重约为25 ～ 30 g,购于河南省实验动物中心【SCXK(豫)2017-0001】,饲养于商丘美兰生物工程有限公司动物实验室【SYXK(豫)2017-0006】。 饲养期间各组小鼠自由饮水,饲喂普通维持饲料由河南省实验动物中心【SCXK(豫)2017-0001】提供。 饲养环境:温度控制在22 ～ 25℃,湿度50% ～ 60%,自动光控(昼夜各半循环照明)。 所有操作均符合商丘师范学院实验动物伦理学要求(2021-5)。

1.1.2 主要试剂与仪器

T-Vector pMD 19(Simple) 载体(TaKaRa,日本);限制性内切酶BamH I(TaKaRa,日本);限制性内切酶SalI(TaKaRa,日本);DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa,日本);DNA Marker (TaKaRa,日本);pET-32a 载体(Promega,美国);蛋白Marker(博士德,中国);2 × Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司,中国);琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司,中国);高纯度质粒小提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司,中国);大肠杆菌(E.coli) DH5α 和BL21(DE3)感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司,中国);IPTG 诱导剂(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,中国);蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司,中国);氨苄霉素(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,中国);刀豆蛋白(ConA,上海源叶生物有限公司);NC 膜(北京索莱宝科技有限公司,中国);辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(EarthOx,美国);布鲁氏菌(外膜蛋白OMP25)特异性IgG ELISA 检测试剂盒(RD,美国);细胞因子ELISA 检测试剂盒(RD,美国);RPMI 1640 细胞培养液(Gibco 生命科技公司,美国);胎牛血清(Gibco 生命科技公司,美国);一次性细胞培养板(Gibco 生命科技公司,美国)。

微量移液枪(Eppendorf,德国);PCR 仪(nexus GSX1,Eppendorf,德国);凝胶成像系统(Gel Doc XR+, Bio-Rad, 美国); 高速离心机( MiniSpin,Eppendorf,德国);冷冻离心机(Centrifuge 5810R,Eppendorf,德国);电子分析天平(FA2204,上海舍岩仪器有限公司,中国);电热恒温培养箱(DNP-9052,上海舍岩仪器有限公司,中国);恒温摇床(OLB-200B,欧莱博,中国);电泳仪、电泳槽和半干式转膜系统(北京六一生物科技有限公司,中国);分子杂交箱(Big SHOT III,Boekel Scientific,美国);生物安全柜(BIO II A,Telstar,西班牙)。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建与鉴定

利用Primer5.0 软件,根据GenBank 登录的布鲁氏菌16M 的omp25 基因序列(BMEI1249)设计引物(表1)。 以布鲁氏菌16M 基因组为模板,PCR 扩增omp25 基因。 利用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,将扩增产物进行回收纯化后,克隆至pMD 19-T simple 载体,获得重组质粒。 采用限制性内切酶BamH I/SalI 对质粒进行酶切后与pET-32a载体相连,获得pET OMP25-32a 质粒。 质粒经BamH I/SalI 双酶切鉴定后,由公司测序鉴定。 转化鉴定正确的质粒至E.coliBL21 感受态细胞,获得克隆菌。

表1 omp25 基因的引物序列Table 1 Primers for the omp25

1.2.2 重组蛋白的表达与纯化

将克隆菌培养至OD600约为0.4 h,取2 mL 菌液后,在剩余菌液中加入终浓度1 mol/L 的IPTG 进行诱导,诱导2、4 和6 h 时各取2 mL 菌液,通过12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测OMP25 表达情况。 蛋白通过蛋白纯化试剂盒进行纯化后,利用SDS-PAGE 电泳对纯化效果检测。

1.2.3 免疫小鼠

参照相关文献[11]对BALB/c 小鼠进行免疫。将6 周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为3 组,每组5只。 第1 组皮下注射弗氏佐剂乳化rOMP25(含50 μg 的rOMP25),免疫3 次,每次间隔2 周。 第2 组第只腹腔注射1 × 106CFU 的Rev.1,第3 组腹腔注射200 μL 的PBS。

1.2.4 rOMP25 蛋白免疫小鼠后诱导细胞因子水平分析

三免后第6 周处死小鼠,参照相关文献[12]无菌分离脾细胞,测定细胞因子的水平。 用rOMP25、ConA(阳性对照)或RPMI 1640 细胞培养液(阴性对照)刺激小鼠脾细胞,检测细胞因子IFN-γ 和IL-2的水平。

1.2.5 血清学分析

小鼠免疫后,采用鼠尾采血法于第2、4、6、8 周采集小鼠外周血,分离血清[13]。 参照相关文献[14],利用小鼠血清IgG 和IL-10 ELISA 检测试剂盒测定小鼠血清中IgG 和IL-10 水平。

1.2.6 Western Blot 分析

参考相关文献[15],取1 μg 纯化的rOMP25 蛋白,进行SDS-PAGE 电泳,将目的凝胶块切下,200 mA 电流转膜1 h,用5 mL 5%脱脂奶粉封闭1 h 后,以rOMP25、Rev. 1 和PBS 免疫小鼠的血清(1 ∶300)为一抗,以HRP 标记的羊抗鼠IgG(1 ∶2000)为二抗,经Western Blot 检测rOMP25 的反应原性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组质粒(pET OMP25-32a)的构建与鉴定

利用PCR 扩增omp25 基因后,获得642 bp 的基因片段,与预期大小(642 bp)相符(图1),表明omp25 基因正确扩增。

将构建的重组质粒pET OMP25-32a 进行BamH I/SalI 双酶切后,发现两条条带,5900 bp 的条带系pET-32a,642 bp 的条带系omp25(图2),与载体片段及目的片段的预期大小(642 bp)一致,且公司测序结果与GenBank 中布鲁氏菌16M 菌株的omp25基因序列同源性达100%,未发生碱基错配,表明重组质粒pET OMP25-32a 构建正确。

2.2 rOMP25 的表达与纯化

将重组质粒pET OMP25-32a 转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在菌液中加入IPTG 后进行SDS-PAGE 检测,rOMP25 在(40.8 × 103)处出现与预期蛋白分子质量(40.8 × 103)大小一致的蛋白条带(图3A),表明rOMP25 表达正确,且在IPTG 诱导6 h 时表达量最高。

菌体超声破碎后,经蛋白纯化试剂盒纯化后,SDS-PAGE 检测结果显示,在40.8 × 103处出现单一蛋白条带(图3B)。

2.3 rOMP25 可诱导细胞免疫反应

为了检测rOMP25 诱导的细胞免疫反应,rOMP25、Rev.1 和PBS 免疫小鼠6 周后,处死小鼠,无菌摘除脾,分离脾细胞,检测脾细胞中IFN-γ 和IL-2 水平。 免疫小鼠的脾细胞用rOMP25、ConA 或RPMI 1640 进行刺激。 当用ConA 刺激时,免疫rOMP25 小 鼠 脾 细 胞 IFN-γ 表 达 量 为 873.68 pg/mL,IL-2 的表达量为655.21 pg/mL,表达水平与免疫PBS 小鼠脾细胞产生IFN-γ 和IL-2 的水平相似(P＞ 0.05),免疫rOMP25 小鼠较免疫PBS 小鼠无显著性差异(图4)。 免疫Rev.1 小鼠脾细胞IFNγ 的表达量为879.98 pg/mL,IL-2 的表达量为761.16 pg/mL,表达水平与免疫PBS 小鼠脾细胞产生IFN-γ 和IL-2 的水平相似(P＞ 0.05),免疫Rev.1 小鼠较免疫PBS 小鼠无显著性差异(图4)。 当用RPMI 1640 刺激脾细胞时,各组产生的细胞因子较少(图4)。 当用rOMP25 刺激时,免疫rOMP25 小鼠脾细胞IFN-γ 的表达量为1655.98 pg/mL,IL-2 的表达量为1108.79 pg/mL,表达水平显著高于免疫PBS 小鼠脾细胞产生IFN-γ 和IL-2 的水平(P＜0.01)(图4)。 免疫Rev.1 小鼠脾细胞IFN-γ 的表达量为1732.23 pg/mL,IL-2 的表达量为1215.15 pg/mL,表达水平显著高于免疫PBS 小鼠脾细胞产生IFN-γ 和IL-2 的水平(P＜ 0.01)(图4)。 表明小鼠免疫rOMP25 后,可诱导细胞免疫反应。

2.4 rOMP25 可诱导体液免疫反应

采集rOMP25、Rev. 1 和PBS 免疫小鼠后的血清,检测血清中IgG 水平。 发现rOMP25 和Rev. 1免疫组产生IgG 的水平较高,两组无显著性差异(P＞ 0.05),IgG 的水平在免疫后第6 周到达高峰(图5)。 但是注射PBS 的小鼠产生的IgG 较低(图5)。 表明rOMP25 可诱导体液免疫反应。

2.5 rOMP25 可抑制炎症反应

采集rOMP25、Rev.1 和PBS 免疫小鼠后不同时间点的血清,检测血清中抗炎因子IL-10 的水平。发现rOMP25 和Rev.1 免疫组产生IL-10 的水平较高,免疫rOMP25 小鼠较免疫Rev.1 小鼠无显著性差异(P＞ 0.05)(图6)。 但是注射PBS 的小鼠产生的IL-10 较低(图6)。 表明rOMP25 后可抑制机体的炎症反应。

2.6 rOMP25 的反应原性分析

为了检测 rOMP25 蛋白的反应原性, 以rOMP25、Rev.1 和PBS 免疫小鼠的血清作为一抗,以HRP 标记的羊抗鼠IgG 作为二抗,进行Western Blot 分析。 结果显示,rOMP25 和Rev.1 免疫的小鼠出现血清反应,但PBS 免疫的小鼠血清无反应(图7),表明rOMP25 具有良好的反应原性。

3 讨论

近年来,越来越多的研究者致力于布鲁氏菌亚单位疫苗的研发,外膜蛋白的疫苗潜力已受到人们的重视。 布鲁氏菌的外膜蛋白按其分子量可分为3组,其中第3 组(25 × 103～ 31 × 103)具有高度同源性,参与布鲁氏菌的毒力[16]。 OMP25 是布鲁氏菌的主要外膜蛋白之一,研究发现,OMP25 与毒力有关,牛种布鲁氏菌omp25 突变株在机体内是减毒的[17-19]。 用抗OMP25 的抗体对动物进行被动免疫,可提供较强的免疫保护力,进一步证实了OMP25 在布鲁氏菌毒力中的作用,以及OMP25 作为疫苗候选抗原的重要性[20]。 已有研究报道,将OMP25 DNA 疫苗免疫BALB/c 小鼠后,可保护小鼠免受羊种布鲁氏菌的侵袭[21]。 也有研究表明,牛种布鲁氏菌的重组OMP25 蛋白也可为BALB/c 小鼠提供保护力,抵抗牛种布鲁氏菌的感染[22]。 因此,OMP25 为较好的亚单位疫苗候选抗原。

由于布鲁氏菌为兼性胞内寄生菌,因此,细胞免疫是清除布鲁氏菌的关键[23]。 早期研究也证明,能够诱导较强的细胞免疫反应的疫苗株可有效地预防布鲁氏菌病[24]。 IFN-γ 是一种重要的效应细胞因子,它能刺激巨噬细胞有效地杀死和清除细胞内的布鲁氏菌[25]。 IL-2 为T 细胞生长因子,可促进Th1 型和Th2 型细胞分化,并激发B 细胞生长及抗体产生[26]。 在本研究中,我们探讨了rOMP25 免疫小鼠后,诱导机体产生的免疫应答情况。 从免疫rOMP25 小鼠中无菌分离脾细胞,并在体外用rOMP25 刺激,可产生较高水平的IFN-γ 和IL-2,表明rOMP25 可诱导机体产生强烈的细胞免疫应答。此外,在布鲁氏菌感染期间,体液免疫反应发挥重要重要作用[27]。 本研究发现,小鼠免疫rOMP25后,产生了较高水平的IgG,且在三免后第6 周达到高峰,表明rOMP25 可诱导机体产生体液免疫反应。IL-10 是一种介导免疫抑制的细胞因子,可促进B细胞增殖分化及抗体产生。 本研究发现,小鼠免疫rOMP25 后,可产生较高水平的IL-10,表明rOMP25可抑制机体的炎症反应。

目前,布鲁氏菌的许多外膜蛋白已被用于开发亚 单 位 疫 苗, 如 OMP10[28-29]、 OMP19[28-29]、OMP28[29]、OMP25c[30]以及OMP31[31]等。 这些亚单位除了产生免疫反应外,还具有一定的保护力。本研究发现rOMP25 可作为亚单位疫苗候选抗原,但还需进一步评价其产生的保护能力。

本研究成功表达并纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP25,小鼠rOMP25 免疫后产生的免疫水平较高,且rOMP25 可抑制炎症反应。 此外,rOMP25 具有良好的反应原性。 因此,在布鲁菌亚单位疫苗抗原筛选中OMP25 是其理想的候选抗原。 然而,还需进一步检测rOMP25 的保护效果。

参 考 文 献(References)

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