胰腺癌小鼠模型研究进展

苗晋鑫,张钟允,王峥,宋韶鹤

(1.河南中医药大学 中医药科学院,郑州 450000;2.河南中医药大学第一附属医院 药学部,郑州 450000)

胰腺癌是最致命的人类恶性肿瘤之一,发病率在全球范围内各不相同,但总体却逐年上升。 胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)占所有胰腺恶性肿瘤的85%以上,预计到2030 年成为癌症相关死亡的第二大原因[1]。 尽管手术技术和辅助治疗取得了进步,但是胰腺癌5 年生存率仍约为9%[2]。 需要开发早期检测方法和有效治疗方法来改善胰腺癌患者预后。 研究胰腺癌发病机制、转移及药物评价对改善胰腺癌患者预后至关重要。胰腺癌小鼠模型是研究人类胰腺癌发生发展、转移、药物开发和治疗方式的常用体内模型。 胰腺癌小鼠模型主要分为诱导模型、移植瘤模型、基因工程模型。 我们在《中国比较医学杂志》和《中国实验动物学报》发表结直肠癌、黑色素瘤、食管癌一系列肿瘤小鼠模型的分类[3-5]。 这些类型的肿瘤小鼠模型是研究人员经常选择的动物模型,但是没有一种模型能概况胰腺癌发生发展及评价药物与治疗方法,需要根据特定研究目的选择适宜的胰腺癌小鼠模型。 本文旨在介绍常用胰腺癌小鼠模型方法、特征及用途等方面,比较优缺点,为胰腺癌研究提供理论依据。

1 诱导性胰腺癌模型

诱导性胰腺癌小鼠模型多为致癌因素对小鼠的胰腺直接或间接接触,使胰腺发生癌变形成胰腺癌小鼠模型。 化学药物诱导小鼠模型是通过化学致癌物使小鼠胰腺细胞发生恶变引起胰腺癌。 亚硝胺类致癌物是胰腺癌诱发致癌物,我们在食管癌文章中已经说明亚硝胺类化学物不在用于动物实验。 因此,N-亚硝基-2-氧基丙胺不再阐述,本文介绍二甲基苯并蒽(dimethyl benz anthracene,DMBA)、重氮乙酰丝氨酸(o-diazoacetyl-L-serine,AZA)在小鼠中的应用。

Osvaldt 等[6]将1 mg 的DMBA 注射到雄性CF-1小鼠的近端胰腺,建立原位胰腺癌小鼠模型。 该模型组织病理显示,17%的小鼠具有反应性增生和腺癌, 67% 具有胰腺腺管内上皮瘤( pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)病变。 另外研究人员利用AZA 每天1 次的灌胃或腹腔注射C57BL/6 小鼠3 周建立PanIN 小鼠模型用于研究高脂肪饮食改变了肠道微生物群的组成,并参与AZA 致癌物诱导的胰腺癌进展[7]。 研究发现DMBA 或AZA 诱导的胰腺癌小鼠模型可产生PanIN 病变和导管腺癌,其组织学与人类胰腺癌相似[6-7]。 但是,诱导的周期长、死亡率高、不能全部成瘤,并可引起其他部位肿瘤且诱导时间长短与病灶发展关系不明确,限制了该模型的应用。

2 移植性胰腺癌模型

移植性胰腺癌模型是用胰腺癌细胞系或胰腺癌组织(人或动物)移植到小鼠体内形成的移植性胰腺癌模型。 根据移植位置,可分为异位移植和原位移植;根据移植物供体与受体间的关系,可分为同种移植和异位移植。 我们根据移植位置和移植物来源进行动物模型总结分析。

2.1 胰腺癌的异位移植模型

异位移植模型是将体外培养的胰腺癌细胞或胰腺癌组织接种到同原发部位不相关的动物皮下[8]。 异位(皮下瘤)模型操作简单、接种成活率高,监测肿瘤方便且模型重复性好,是临床前常用的动物实验模型[9]。 然而,皮下瘤在形态、血管密度、免疫细胞浸润和肿瘤微环境与内脏肿瘤不同,同时皮下瘤极少发生转移,与人类肿瘤生物学特性有差异[10]。

2.1.1 同种移植皮下模型

将小鼠胰腺癌细胞植入相同品系小鼠皮下制备同种移植皮下模型。 同种移植肿瘤细胞,肿瘤具有较短潜伏期和可靠的生长动力学,同时该模型具有免疫系统的完整性,是研究免疫治疗和靶点治疗的很好模型。 研究人员将1 × 106cells/100 μL Panc02 小鼠胰腺癌细胞注射C57BL/6 小鼠皮下,成功建立有完全免疫能力的胰腺癌小鼠模型,评估PD-1 抗体和OX40 抗体联合PancVAX 疫苗可有效抗胰腺癌[11]。 Hy15549 和Han4.13 小鼠胰腺癌细胞系来自Ptf1-Cre;LSL-KRAS-G12D;p53Lox/+小鼠原发性胰腺肿瘤,分别与C57BL/6 和FVB 小鼠品系同源。 Erstad 等[12]将1×104cells/100 μL Hy15549和Han4.13 小鼠胰腺癌细胞分别注射C57BL/6 小鼠和FVB 小鼠腹侧皮下和胰腺原位。 同种原位比皮下肿瘤生长得更快、更大,同时利用两种小鼠模型评估FOLFIRINOX 治疗效果。 MPC-83 小鼠胰腺癌细胞是我国建立的第一株小鼠可移植性胰腺腺泡细胞癌株,其瘤源来自昆明种小鼠[13]。 研究者通过MPC-83 建立皮下移植瘤发现白细胞介素-6 明显促进胰腺肿瘤细胞的增殖生长作用[14]。

2.1.2 异种移植皮下模型

将人胰腺癌细胞或组织植入免疫缺陷小鼠皮下制备异种移植皮下模型。 此类模型常选用免疫缺陷小鼠如裸鼠、NOD-SCID 和NSG 小鼠。 人源细胞异种移植(cell line derived xenograft,CDX)模型和患者肿瘤组织异种移植(patient derived xenograft,PDX) 模型在肿瘤模型研究中广泛应用。 Conti等[15]将4×106cells/100 μL PaCa44 人胰腺癌细胞皮下注射CD1 裸鼠腹部右侧,成功构建胰腺癌CDX模型,用于评估HFt-MP-PASE-MIT 纳米制剂的疗效和副作用。 将患者来源的原代胰腺癌细胞注射或胰腺癌组织块植入到免疫低下的小鼠体内,建立胰腺癌异种移植模型。 研究者将患者胰腺癌组织块皮下植入6 周的NOD-SCID 小鼠,成功建立胰腺癌PDX 小鼠模型[16]。 使用这种肿瘤块植入的方法能更多的保留人类肿瘤基质成分(10 代以内),而原代细胞移植则没有此特征。 基于此胰腺癌PDX 模型开发了核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)显微镜跟踪放射性标记的丙酮酸在体内转化为乳酸盐的过程的生物标志物,以确定可用于临床的胰腺肿瘤侵袭性。 商品化和患者原代胰腺癌细胞系生成的CDX 模型缺乏原发性胰腺肿瘤的肿瘤细胞和基质细胞异质性,PDX 模型解决了CDX 模型的局限性,且应用于临床前药物评价(表1)。

表1 PDX 模型评估PDAC 药物疗效的临床前研究Table 1 Preclinical study of PDX model to evaluate the efficacy of PDAC drugs

类器官作为一种新型体外研究系统,可高度模拟体内组织、器官生物学特性,可用于不同组织和器官生理、病理及药物作用的过程研究[23]。 常用方法是首先将获得患者胰腺癌组织切碎,然后利用消化液将胰腺细胞消化分散,并与含有生长因子和调节剂的培养基一起置于基质(胶原蛋白或基质胶)中培养,细胞在2 d 内形成器官样结构[24]。 Seino等[25]利用CRISPR/Cas9 系统对导管类器官进行了PDAC 驱动基因(Kras、Cdkn2a、Smad4 和Tp53)编辑,编辑后的导管类器官种移植于BALB/c 裸鼠皮下,建立同人类基因的PDAC 小鼠模型。 结果发现,编辑后4 个基因类器官形成的肿瘤细示核异型性和肿瘤出芽,这与PDAC 组织学相似。

2.2 胰腺癌的原位植入模型

原位胰腺癌模型是通过胰腺原位注射细胞悬液或胰腺肿瘤细胞植入建立的动物模型。 其优势包括可利用相关位点进行肿瘤-宿主相互作用,肿瘤转移的发展,治疗的部位特异性和依赖性,基因的器官特异性表达等研究以及可复制临床情况。但此建模方法技术难度大,价格昂贵,实验周期较长[26]。

2.2.1 同种原位移植模型

Adjuto-Saccone 等[27]采用5×105cells/100 μL PK4A 小鼠胰腺肿瘤细胞原位注射Ink4a/Arffl/fl;LSL-KrasG12D转基因小鼠胰腺,证明TNF-α 诱导小鼠胰腺肿瘤相关成纤维细胞( cancer-associated fibroblasts,CAFs)增加,揭示了胰腺癌发展的内皮-间质转化机制。 另一项研究,将1 × 106cells/100 μL DT6606 小鼠胰腺癌原位注射C57BL/6 小鼠胰腺尾,建立全免疫能力的胰腺癌小鼠模型评估VVL-21 痘苗溶瘤病毒协同PD-1 抗体增强抗肿瘤作用[28]。 同时该研究还利用胰腺皮下小鼠模型和胰腺原位叙利亚仓鼠模型评价VVL-21 的抗肿瘤作用[28]。 Hwang 等[29]将PAN02 小鼠胰腺癌细胞皮下注射到裸鼠侧腹制备肿瘤块,该肿瘤块原位植入C57BL/6 的胰尾并切除脾,建立脾切除原位同源小鼠胰腺癌模型。 结果发现,脾切除后增强原位同源小鼠胰腺癌小鼠模型中肿瘤生长和腹膜播散。 为提高异种移植成功率提供一种手术方法。

2.2.2 异种原位移植模型

由于胰腺是内脏组织,将胰腺癌细胞系携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)荧光基因或是荧光素酶等,对于原位监测非常方便。 Moreno等[30]将50 μL 的3 × 106/mL PANC-1-GFP 细胞悬液原位注射BALB/c 裸鼠胰腺,成功建立异种原位胰腺癌小鼠模型。 荧光活体成像结果显示,肿瘤体积随着时间增加显著增大,且出现脾、肝和胃肠道多组织转移。 2020 年,冷泉港实验室的研究人员分别将5 × 104～5 × 105的人患者来源的类器官单细胞悬液注射小鼠胰腺导管内和5 × 105的人患者来源的类器官单细胞悬液注射小鼠胰腺尾内,成功建立胰腺导管内移植类器官(intraductal transplantation of organoids,IGO)胰腺癌小鼠模型和胰腺尾内移植类器官胰腺癌小鼠模型[31]。 IGO 模型是将类器官单细胞悬液注射到免疫缺陷小鼠主胰腺导管中,该模型更好概括从导管系统内侵袭前细胞到组织侵袭性导管外肿瘤伴周围发育不全的进展。 上述胰腺癌原位类器官移植小鼠模型模拟人类胰腺癌更相似。

3 基因工程小鼠胰腺癌模型

人类胰腺癌中已经发现多种遗传基因、表观遗传基因异常。 抑癌基因和致癌基因的异常突变导致肿瘤的发生和发展[32]。 通过引入特定的致癌基因突变、灭活抑癌基因对小鼠进行基因修饰建立胰腺癌基因工程小鼠模型。 基因工程小鼠对胰腺癌基因组分析确定分子亚型评估对胰腺癌的生物学和病理学影响。 此外,基因工程小鼠模型为临床前靶向治疗和新型免疫疗法提供可靠的评价工具。多种此类基因工程小鼠模型用于研究胰腺上皮内皮瘤变和胰腺癌[33]。 由于Kras 突变不足以诱导进展到胰腺腺癌的侵袭期,因此多基因的转基因小鼠PDAC 和转移性疾病的组合模型开发并用于临床前研究。 常见基因工程小鼠模型基于Kras 突变和其他基因缺失或突变修饰,本文主要介绍目前常用的几种小鼠模型。

3.1 PDX-1-Cre,LSL-KrasG12D,LSL-Trp53R172H/-转基因小鼠

Hingorani 等[34]建立靶向PDX-1-Cre 小鼠胰腺同时表达KrasG12D和Trp53R172H的转基因小鼠。 8 ～10 周 龄PDX-1-Cre、LSL-KrasG12D、LSL-Trp53R172H/-(KPC)小鼠呈现早期PanIN 病变,10 周龄以后小鼠发生胰腺癌,同时显示出与人类疾病相似的临床特征(恶病质、肠和胆道阻塞、出血性腹水),且在12个月前死亡。 组织病理学显示与人类相似,免疫组化表达CK19,肝和肺的转移与胰腺原发灶相似。 研究人员利用KPC 小鼠研究PDAC 的发展进程和评价免疫治疗药物[35]。 KPC 模型是研究PDAC 最多的基因工程小鼠模型之一。

3.2 PDX1-Cre,KrasG12D,Ink4a/Arfflox/flox 转基因小鼠

患者胰腺肿瘤经常INK4A 缺失,但是Ink4a/Arf (Cdkn2a)基因座的两个或任何一个组成部分缺失的小鼠不会自发性胰腺癌[36]。 Aguirre 等[37]首先使用Cre 介导的突变 Kras (KrasG12D)激活和条件性Ink4/Arf 肿瘤抑制等位基因缺失建立3 基因的转基因小鼠。 结果发现小鼠在7 ～ 11 周龄时出现体重减轻、腹水、黄疸、腹部出现肿块以及垂死等症状。组织病理结果显示,初期可检测到PanIN-1 病变,12周则出现导管病变,肿瘤小鼠腺体形态与人胰腺导管腺癌相似。 此模型概括了多种恶行肿瘤及胰腺癌经典特征,可用于开发抑制肿瘤恶性生长的分子靶向治疗。

3.3 其他

胰腺癌有超过30 种不同的转基因小鼠模型且具有不同的表型[38]。 基于Kras 突变的转基因小鼠已通过p53、Mist、Smad4、TGFβ基因的缺失或突变进行修饰获得胰腺癌转基因小鼠模型[39-41]。 另外一些遗传性胰腺癌综合征小鼠模型是一个或多个基因突变,如Brca2 突变小鼠在胰腺癌转基因的背景下表型差异很大[42]。

4 胰腺癌小鼠模型的优缺点

胰腺癌小鼠模型在胰腺癌发生、发展、分子机制和治疗研究中起着至关重要的作用。 3 种不同类型胰腺癌小鼠模型有各自模拟人类胰腺癌特征(表2)。 诱导性小鼠模型常用于研究PanIN 病变过程和导管腺癌。 皮下移植的胰腺癌小鼠模型成瘤重复性好和测量方便,用于评估瘤生长及药物疗效,但极少发生转移,且测试药物反应时与人原肿瘤部位可能不一致。 原位植入的胰腺癌小鼠模型概括了胰腺癌原位发生及转移特征,尤其是类器官原位移植小鼠模型,多用于评估抗肿瘤及转移药物。 同种移植胰腺癌小鼠模型由于有全免疫,多用于免疫治疗。 基因工程小鼠可用于探究胰腺癌相关基因在疾病中的机制作用及用于研究新疗法(新型免疫疗法)并评估预防癌症策略,但靶向胚胎的胰腺基因激活或失活以启动肿瘤发生,这与人类胰腺肿瘤的发展仍有区别。 不同胰腺癌小鼠模型的特征可用于不同实验研究,选择合适的小鼠模型很重要。由于小鼠代谢与人类相差较大,提示我们可构建人源化小鼠用于胰腺癌的研究。 总之,胰腺癌小鼠模型为胰腺癌的研究提供理论基础和科学依据。

表2 胰腺癌小鼠模型的优缺点Table 2 Advantages and disadvantages of pancreatic cancer mouse models

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