miR-497对THP-1巨噬细胞NLRP1表达及胆固醇流出的影响

罗清宇 曾高峰 黄斌 陈孔 秦英楠

(南华大学附属第二医院 1功能检查科，湖南 衡阳 421000；2心血管内科)

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性心血管疾病，是工业化社会和世界范围内死亡的主要原因〔1〕。巨噬细胞对低密度脂蛋白(LDL)的修饰是导致泡沫细胞形成的主要过程，并有助于炎症环境和AS斑块进展〔2〕。巨噬细胞源性泡沫细胞中脂质沉积的减轻是一种很有前途的AS治疗策略〔3〕。研究表明，NOD样受体家族，含有Pyrin结构域NLR家族蛋白(NLRP)1炎性体在AS发展中起重要作用〔4〕。据报道，活化的NLRP1炎性体促进巨噬细胞源性泡沫细胞的形成〔5〕。因此，寻找调控NLRP1表达和抑制炎症反应的潜在机制对于AS的防治具有重要意义。随着分子生物学的发展，分子生物标志物的研究为各种疾病治疗提供了有效的治疗靶点。据报道，miRNA是一类小RNA，参与AS的进展，并被认为是AS的潜在生物标志物和有吸引力的治疗方法〔6〕。在众多miRNA中，miR-497广泛参与细胞分裂、代谢及应激反应；之前研究证实在人肾小球系膜细胞中miR-497可抑制NLRP1蛋白的表达，降低促炎细胞因子释放〔7,8〕。然而，作为研究AS的经典细胞模型，人单核细胞白血病(THP)-1巨噬细胞中miR-497是否可靶向抑制NLRP1表达，目前尚不清楚。本研究旨在分析miR-497是否通过抑制THP-1巨噬细胞NLRP1，促进胆固醇流出。

1 材料与方法

1.1细胞培养和泡沫细胞形成 人THP-1单核细胞购自美国ATCC公司。将细胞在含有10%胎牛血清(FBS，美国Hyclone公司)、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 μg/ml)均购自美国Sigma-Aldrich公司的RPMI1640培养基(美国HyClone公司)中培养。将细胞培养在含有5% CO2的37℃加湿培养箱中。对于实验，将细胞以1.0×105个细胞/ml的密度接种在35 mm培养皿或96孔板中，并通过加入100 ng/ml佛波酯孵育细胞24 h，使其诱导分化成巨噬细胞。通过向含有0.3%牛血清白蛋白(BSA，美国HyClone公司)的无血清RPMI1640培养基中加入100 μg/ml的氧化型LDL(Ox-LDL)(美国Sigma-Aldrich公司)将巨噬细胞转化为泡沫细胞。

1.2miR-497 mimic和载体转染与分组 收集Ox-LDL诱导分化的巨噬细胞源性泡沫细胞，用脂质体2000转染试剂(美国Sigma-Aldrich公司)，将不同浓度(20、40、60、80、100、120 nmol/L)miR-497 mimic转染入细胞。加入乱码miR-497作为对照。将细胞在37℃下孵育12 h，随后收集细胞并进行细胞活力检测。收集Ox-LDL诱导分化的巨噬细胞源性泡沫细胞，用脂质体2000转染试剂(美国Sigma-Aldrich公司)，将80 nmol/L miR-497 mimic转染入细胞，处理不同时间(12 h、24 h、48 h)后，收集细胞并进行细胞活力、Western印迹、油红O和Dil ox-LDL染色检测。将80 nmol/L miR-497 mimic转染入细胞处理0 h作为对照组。

为了考察miR-497和NLRP1之间的关系，将细胞分为3′UTR-WT组、3′UTR-WT+乱码miR-497组、3′UTR-WT+miR-497 mimic组、3′UTR-MUT+乱码miR-497组和3′UTR-MUT+miR-497 mimic组。其中，3′UTR-WT组、3′UTR-WT+乱码miR-497组、3′UTR-WT+miR-497 mimic组分别将包含NLRP1的3′UTR-WT载体单独或与乱码miR-497、miR-497 mimic转染巨噬细胞源性泡沫细胞；3′UTR-MUT+乱码miR-497组和3′UTR-MUT+miR-497 mimic组分别将包含NLRP1的3′UTR-MUT载体与乱码miR-497、miR-497 mimic转染巨噬细胞源性泡沫细胞。在转染后24 h，测定荧光素酶活性。

为了考察miR-497 mimic转染对NLRP1表达影响，将细胞分为：对照12 h组、miR-497 mimic 12 h组、对照24 h组、miR-497 mimic 24 h组、对照48 h组和miR-497 mimic 48 h组。对照12 h组、对照24 h组、对照48 h组分别用乱码miR-497转染巨噬细胞源性泡沫细胞12 h、24 h、48 h。miR-497 mimic 12 h组、miR-497 mimic 24 h组、miR-497 mimic 48 h组分别用miR-497 mimic转染巨噬细胞源性泡沫细胞12 h、24 h、48 h。收集细胞并进行Western印迹检测和实时荧光定量(RT-qPCR)分析NLRP1表达情况。

1.3细胞活力测定 使用CCK-8测定法(北京碧云天生物技术公司)评估细胞存活率。将上述处理的THP-1单核细胞小心地除去培养基，并向每个孔中加入100 μl含有CCK-8(RPMI1640培养基和CCK-8体积比为9∶1)的培养基。在37℃在黑暗中温育1 h后，用SynergyHT多功能酶标仪(美国Winooski公司)测量每个孔在450 nm的光密度。

1.4胆固醇流出评估 油红O和Dil Ox-LDL染色用于检测细胞中的脂质积累和胆固醇流出情况。对于油红O染色，将细胞用新鲜稀释的0.5%油红O溶液在37℃染色10 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，使细胞可视化并在IX-71荧光显微镜(日本Olympus公司)下拍照。对于Dil Ox-LDL染色，将THP-1巨噬细胞与30 μg/ml用RPMI1640培养基稀释的Dil Ox-LDL在37℃黑暗中温育6 h。用PBS洗涤2次后，在荧光显微镜下观察并拍照。根据制造商的方案，使用胆固醇流出荧光测定试剂盒(美国Biovision公司)定量细胞中的胆固醇流出量。通过将培养基的荧光强度除以细胞裂解物和培养基的总荧光强度来计算处理的胆固醇流出量。

1.5Western印迹分析 使用RIPA裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白质。使用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(北京碧云天生物技术公司)评估收集的蛋白质的浓度。在聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，将蛋白质样品(50 μg)转移到聚偏氟乙烯膜上。用含有5%低脂牛奶的Tris缓冲盐-吐温20(TBST)封闭缓冲液封闭后，将膜与针对NLRP1、CD36、白细胞介素(IL)-1β、IL-18及3-磷酸甘油醛胱氢酶(GAPDH)(1∶1 000)的一抗(美国Cell Signaling Technology公司)在4℃温育过夜。用TBST洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶耦联的二抗〔(1∶8 000)购自美国Abcam公司〕在室温下孵育2 h。再次用TBST洗涤后，使用增强的化学发光试剂检测免疫复合物。使用Bio-Rad Quantity One软件(美国Bio-Rad Laboratories公司)定量蛋白质条带。

1.6荧光素酶报告基因探讨miR-497与NLRP1的直接作用 使用引物5′-TCCGAGCTCCACCCTAGCCAATGTCTCCT-3′和5′-TGCTCTAGAGGAGCTGAA-GGCTTCTCAAA-3′通过PCR扩增含有推定的miR-497靶位点的NLRP1的野生型3′非翻译区(3′UTRWT)的片段。同时通过使用Quik变化诱变试剂盒(德国Stratagene公司)对pGL3-NLRP1-3′ UTR载体上带有的miR-497靶点序列中的seed sequence序列进行点突变。随后，将包含NLRP1的3′UTR-WT(野生型)或3′UTR-MUT(突变型)片段插入紧邻荧光素酶基因序列下游的psiChECK-2载体(美国Promega公司)中。将载体单独或与乱码miR-497、miR-497 mimic转染巨噬细胞源性泡沫细胞。在转染后24 h，通过使用K801-200荧光素酶测定试剂盒(美国Biovision公司)测定荧光素酶活性。

1.7RT-qPCR分析 使用RNA提取试剂盒(美国Promega Corporation公司)提取细胞的总RNA。使用30 ng总RNA和1 μmol/L环状引物进行逆转录反应。反应条件如下：85℃ 5 min，4℃ 5 min。通过MX3000p实时PCR检测系统(美国Stratagene公司)使用标准SYBR Green Assay方案进行实时PCR。 25 μl PCR包括2 μl逆转录产物，1×PCR Master Mix(日本Takara公司)，1.5 μmol/L正向引物和0.7 μmol/L反向引物。将反应物在96孔板中于95℃温育10 s，然后进行40个循环，95℃ 5 s，60℃ 30 s。通过2-Ct计算每个基因的相对表达，并用GAPDH进行归一化。用于qPCR扩增的引物序列如下：NLRP1正向引物：5′-CTGTCGCTTCTCAAT CAGACTC-3′；反向：5′-CCCAGGTCATTTCCCATC-ACTT-3′，β-actin正向引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′；反向：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAA-GAG-3′。

1.8统计学处理 所有实验独立重复至少3次。采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析和独立样本t检验。

2 结 果

2.1各种处理后的细胞活力 为了选择最佳转染条件，使用CCK-8测定不同处理后细胞活力。对照组、miR-497 mimic浓度分别为20、40、60、80、100、120 nmol/L组转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的细胞活力分别为(100.0±1.2)%、(99.6±1.7)%、(97.8±1.8)%、(96.1±1.7)%、(94.2±1.5)%、(82.3±2.0)%、(74.4±1.8)%。80 nmol/L miR-497 mimic转染对照组、12 h组、24 h组、48 h组后，THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的细胞活力分别为(101.3±1.1)%、(100.1±1.8)%、(99.7±1.5)%、(100.0±1.7)%。结果显示，miR-497 mimic转染浓度80 nmol/L是安全的，并且随着转染时间的增加对细胞存活率没有显著影响，而miR-497 mimic浓度在100、120 nmol/L下存活率较对照组显著降低(P<0.05)。因此，选择miR-497 mimic转染浓度80 nmol/L作为研究条件。

2.2miR-497 mimic转染对细胞胆固醇流出的影响 与对照组相比，miR-497 mimic转染后24 h，细胞中的脂质储存显著下降(P<0.05)。转染后24 h开始红色荧光减弱，定量分析显示miR-497 mimic转染后24 h和48 h的胆固醇流出量显著高于对照组(P<0.05)。见表1、图1。表明miR-497 mimic转染促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出。

2.3miR-497 mimic转染对促炎细胞因子释放的影响 与对照组相比，不同miR-497 mimic转染时间组显著降低了THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞NLRP1的表达(P<0.05)，并且CD36和IL-1β、IL-18等促炎因子的表达显著降低(P<0.05)。见表1、图2。这种降低呈时间依赖性。

2.4NLRP1是miR-497的靶基因 根据TargetScan在线分析软件，发现NLRP1和miR-497序列之间存在一个序列特异性结合域，NLRP1是miR-497的靶基因，其结合位点位于NLRP1的3′非翻译区(UTR)上，该靶基因已通过荧光素酶分析验证。荧光素酶报告基因检测3′UTR-WT组、3′UTR-WT+乱码miR-497组、3′UTR-WT+miR-497 mimic组、3′UTR-MUT+乱码miR-497组、3′UTR-MUT+miR-497 mimic组荧光素酶活性分别为1.00±0.08、1.02±0.09、0.38±0.07、0.96±0.06、0.91±0.05。结果表明，与3′UTR-WT+miR-497 mimic组相比，3′UTR-MUT+miR-497 mimic组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与3′UTR-WT组相比，3′UTR-WT+miR-497 mimic组的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)，但对突变型3′UTR的荧光素酶活性无明显抑制作用，说明miR-497能特异性地与NLRP1-3′UTR结合。miR-497 mimic转染对照12 h组、miR-497 mimic 12 h组、对照24 h组、miR-497 mimic 24 h组、对照48 h组、miR-497 mimic 48 h组后，NLRP1 mRNA/β-actin分别为1.02±0.08、0.68±0.05、1.01±0.06、0.42±0.04、1.01±0.05、0.36±0.04。qRT-PCR分析结果显示，与对照组相比，miR-497 mimic可显著抑制NLRP1蛋白和NLRP1 mRNA的表达(P<0.05)。见图3。这种抑制作用呈时间依赖性。

3 讨 论

巨噬细胞源性泡沫细胞是AS斑块的重要组成部分。这种细胞类型在坏死核的形成和慢性炎症的形成中起着至关重要的作用，导致AS斑块的进展和不稳定〔9〕。因此，抑制巨噬细胞源性泡沫细胞中脂质沉积至关重要。miRNA是一类短的非编码RNA，已成为AS中胆固醇代谢的关键调节因子〔10〕。miRNA通过与靶序列的3′UTR结合来抑制mRNA表达，导致靶基因翻译减少或mRNA降解增加〔11〕。本研究中，miR-497 mimic(模拟物)促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出，并且可靶向抑制NLRP1表达，抑制促炎细胞因子产生。

MiR-497属于miR-15/16/195/424/497家族，其成员共享相同的3′-UTR种子序列。miR-497位于人类染色体17p13.1中，几乎存在于所有人体器官和组织中，包括脑、肝脏、心脏和血液〔12〕。miR-497的过度表达增强了细胞分裂、代谢及降低促炎细胞因子释放。王娟娟等〔13〕采用基因芯片分析miR-497高表达对结肠癌细胞HCT116基因表达谱的影响，结果发现miR-497抑制结肠癌细胞HCT116中炎症相关基因mRNA的表达。曹琳等〔14〕研究发现急性脑梗死患者外周血miRNA-497的表达与肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-10水平呈负相关。在这项研究中，NLRP1被证明是miR-497的靶基因，并且过表达的miR-497可显著抑制巨噬细胞源性泡沫细胞中NLRP1 mRNA的表达。

NLRP1炎症小体是一个以NLRP1为基础的分子平台，广泛存在于巨噬细胞、T细胞及单核细胞等细胞中，它控制促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟〔15〕，在AS的发病机制中起重要作用〔5〕，但其机制尚未完全阐明。泡沫细胞的形成被认为是AS起始阶段的标志，并且与AS的发生发展密切相关〔16〕。以往的研究表明，NLRP1炎性体影响巨噬细胞源性泡沫细胞的产生，但结果是有争议的。Li等〔17〕发现腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)激活NLRP炎症小体加速小鼠骨髓巨噬细胞脂质沉积；喻思扬等〔5〕观察到NLRP1炎性体及其下游细胞因子对Ox-LDL诱导的THP-1细胞和人外周血单个核细胞的泡沫细胞形成的抑制作用。相反，Steverson等〔18〕报道NLRP1的沉默增强了巨噬细胞中胆固醇的积累。本研究发现，miR-497 mimic转染后细胞内脂质沉积显著下降，而胆固醇流出在对照组(乱码miR-497对照组)中不太明显。这证实了NLRP1炎性体阻断对巨噬细胞中细胞内脂质积累的正调节作用。目前关于NLRP1炎性体如何影响巨噬细胞中胆固醇体内平衡知之甚少。已知在巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中，Ox-LDL的摄取主要受CD36介导，而CD36的活化由NLRP1炎性体加工的细胞因子IL-1β和IL-18诱导〔19〕。有研究证实IL-1β和IL-18水平降低引起CD36表达的显著抑制〔20〕。本研究发现，经miR-497 mimic转染后，THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的NLRP1、CD36、IL-1β和IL-18表达均较对照组显著降低。上述结果提示，泡沫细胞中的胆固醇流出可能与NLRP1炎性体的抑制有关。

综上，miR-497通过靶向抑制THP-1巨噬细胞NLRP1，促进胆固醇流出，并抑制THP-1巨噬细胞中细胞内脂质的积累。然而，本研究主要集中在miR-497在细胞水平上的作用，而miR-497对AS的影响需要在动物模型中进一步研究。