人乳头瘤病毒分子检测方法在宫颈癌筛查中的应用

刘磊 综述刘婷婷 审校

营口经济技术开发区中心医院（营口市第六人民医院）病理科，辽宁 营口 115007

宫颈癌是危害全球女性健康的第二大常见恶性肿瘤[1]。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)与宫颈癌的发生密切相关[2]。高危型HPV(high-risk HPV，hrHPV)的持续感染是诱发宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及浸润性宫颈癌的重要因素[3]。随着HPV分子检测被纳入宫颈癌筛查指南，分子检测模式的筛选对于临床医生和患者均至关重要。美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)先后批准5种HPV分子检测技术，即HC2 HPV、Cervista HPV HR、Cobas 4800 HPV、Aptima HPV及Onclarity HPV。由于检测方法的多样性，检测结果的一致性变得尤为重要。HC2是首个获得FDA批准的应于临床的HPV检测方法，其以较高的临床敏感性和相对较高的特异性成为常规HPV检测的金标准[4]。本文将以HC2为参考标准，比较不同检测方法的优劣势，并探讨检测结果的一致性问题。

1 HPV的结构和致病机制

HPV是一种无包膜、双链DNA病毒，结构细分为早期(E)、晚期(L)区域和长控制区域，参与的蛋白主要包括衣壳蛋白L1、癌基因蛋白E6/E7[5]。L1具有自我组装成病毒样颗粒的特性，与适当佐剂结合用于HPV疫苗的研发[6]。癌基因E6/E7与宫颈上皮基底细胞基因组整合启动E6/E7的转录合成。E6/E7蛋白产物抑制p53和视网膜母细胞瘤(pRb)的功能，进而诱导高级别上皮内瘤变(CIN2/CIN3)以及宫颈癌的发生[7-8]。至今已鉴定出的hrHPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，疑似高危型有53、66、70、73、82[9]。HPV不同亚型的持续感染诱发宫颈癌的能力各有差异，HPV16/18是宫颈癌发生最主要的亚型，占据约70%；HPV31/33/45/52/58占据约20%[10]。

2 hrHPV检测技术及检测结果与HC2的比较

2.1 HC2 HPVHC2是利用全基因组RNA探针与HPV DNA单链杂交，特异性抗体捕获RNA-DNA杂合体，采用化学发光和信号放大的原理快速捕获的检测方法。该技术可检测13种hrHPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，是一种半定量方法[11]。HC2对实验室无特殊要求，试验数据重复性好，以hrHPV全基因组为靶点，可降低HPV整合引起的假阴性结果。然而，HC2检测技术由于缺乏内对照，样本中真菌乳膏等残留导致的假阴性结果将会报告为阴性而非实验无效[12]。hrHPV探针与低危型HPV(low-risk HPV，LrHPV)亚型存在交叉反应，HC2检测的假阳性率高达18.8%[13]。

2.2 Cervista HPV HRCervista于2009年获 得FDA批准，用于30岁以上妇女宫颈细胞学的联合筛查，以及细胞学诊断为意义不明确的非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)患者的分型检测。Cervista是基于酶切信号放大作用来检测L1、E6、E7特定核苷酸序列的方法。与HC2相比，Cervista能够检测14种hrHPV，增加了基因型HPV66。该方法设有内部质控，避免了样本量不足造成假阴性。然而，Cervista检测与HPV67和HPV70存在交叉反应，导致结果出现假阳性[14]。该方法同样存在HPV定量和分型问题。Cervista和HC2检测结果比较发现，900名细胞学检查均正常的女性，Cervista和HC2检测的特异性分别为90%和96%，两者的一致性为93%，Kappa值为0.5。在65例组织学判读为CIN2+的女性中，Cervista和HC2检测的特异性分别为91%和92%，两者的一致性为95%，Kappa值为0.7[15]。

2.3 Cobas 4800 HPVCobas 4800利用Real-Time PCR技术检测14种hrHPV，并可以明确识别基因型HPV16、HPV18。该技术已被批准用于25岁以上妇女的一线初筛。与HC2相比，Cobas 4800设有β-球蛋白内对照，实现了HPV DNA的定量检测，而且HPV16和HPV18的特异性分型可以进一步对HPV阳性结果进行分类管理。耶鲁大学医学院的一项研究显示，在1 371份标本中，HC2和Cobas 4800检测的阳性率分别为11.38%、13.42%，其中94%的检测结果一致，Kappa值为0.7。在1 371例病例中，两种测定方法结果不一致的有82例(6%)。82例患者中27例(32.9%)为HC2阳性/Cobas 4800阴性，55例(67.1%)为Cobas 4800阳性/HC2阴性。大约有80%的HC2阳性/Cobas 4800阴性病例经Linear Array基因分型检测为LrHPV阳性，而13.3%的Cobas 4800阳性/HC2阴性病例检测为LrHPV阳性。该结果表明，Cobas 4800相比HC2对LrHPV的交叉反应性更低[16]。然而，英国的一项回顾性分析显示，细胞学阴性的患者中Cobas 4800检测的阳性率比HC2增加一倍，但临床中CIN的检出率没有相应提高，可能是Cobas 4800设置的截断值(Cut-off)低于HC2。当Cut-off提高时，Cobas 4800检测结果的特异性升高[17]。

2.4 Aptima HPVAptima是FDA批 准 的 首 个HPV mRNA检测方法，适用于30岁以上和细胞学诊断为ASC-US的21～29岁妇女。该检测分为Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45，Aptima HPV可以检测14种hrHPV，Aptima HPV16/18/45可 以 分 型 检 测HPV16、HPV18、HPV45。Aptima是基于转录介导的扩增技术定性检测HPV E6/E7 mRNA，与HPV DNA相比，特异性更高，可以有效减少HPV一过性感染对检测结果的干扰[18]。然而，Aptima检测与LrHPV也存在交叉反应，但与HC2和Cobas 4800相比交叉反应率较低[14]。一项比较Aptima HPV和HC2的研究表明，两者具有检出CIN2+的敏感性和特异性相当，一致性为96.5%，Kappa值为0.7。然而，在细胞学异常或HPV持续感染12个月以上的患者中，Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45检测阳性的患者转诊阴道镜的数量与HC2相比明显减少[19]。另一项研究表明，423例细胞学异常的患者中，Aptima和HC2具有相似的敏感性，但HC2漏检9例CIN2+患者，推断Aptima可能更适用于宫颈癌初筛[20]。

2.5 Onclarity HPVOnclarity于2018年获得FDA批准，用于宫颈癌的初筛。该系统是基于Real-Time PCR和荧光探针技术的自动化检测系统，检测HPV E6/E7 DNA区域。Onclarity以β-球蛋白作为内对照，能检测13种hrHPV和疑似hrHPV66，并且可以提供6种基因型（HPV16、18、31、45、51和52）的分型检测信息以及不同基因型组别（33/58、35/39/68、56/59/66）的检测方案。有研究显示，除HPV16、HPV18基因型外，其余高危基因型与CIN2+也有显著相关性，尤其是持续感染一年或更长时间[21]。因此，Onclarity HPV分型检测可以为随访患者感染的亚型提供持续监测，亦可应用于疫苗接种效果的评估。Onclarity对比HC2的研究显示，两者检测结果的一致性为92%(150/163)，13个不一致的样本包括4个HC2阳性/Onclarity阴性(3个CIN3和1个原位腺癌)、9个HC2阴性/Onclarity阳性(3个CIN1、6个CIN3和2个经Linear Array基因分型检测也为阴性)[22]。

3 检测结果的一致性分析

HPV初筛结果的一致性分析中，Cervista、Cobas 4800、Aptima和Onclarity与HC2对 比 发 现，检 出CIN2+患者的敏感性和特异性相当。然而，一项针对30～65岁妇女的HPV初筛样本显示，4种不同检测方法(HC2、Cobas 4800、CLART、Aptima)表现出显著差异。在2 881例样本中，23%的样本至少有一种检测方法呈阳性，其中仅42%～58%的样本在所有检测中均呈阳性，不同HPV检测方法的分析设计差异可能是初筛结果不一致的主要原因[23]。另一项系统性分析同样显示HC2、Cobas 4800、Cervista、CLART、Aptima、Onclarity等不同检测方法在初筛结果中表现出差异，大约有30%～50%阳性结果不一致[24]。HPV不同检测方法初筛结果的不一致为宫颈癌筛查，尤其是HPV阳性、细胞学阴性的妇女带来了巨大的挑战。造成HPV初筛结果不一致的原因有很多，包括检测技术的差异，如Real-Time PCR及探针法检测的差异，引物的结合区域、检测通量差异等；检测目标的不同，如HC2、Cervista、Cobas 4800、Onclarity检测HPV DNA，而Aptima检测HPV mRNA；采样部位的差异，有报道显示基于信号放大原理的HPV检测方法对阴道采集样本敏感性和特异性较低，而PCR方法对阴道采集标本和宫颈采集标本敏感性和特异性相当[25]；检测HPV亚型的差异等。针对初筛不一致的问题，建议采用hr-HPV检测联合其他方法筛查，HPV初筛阳性患者可进行细胞学检测作为一次分流管理，细胞学阴性患者可间隔12个月重复hr-HPV检测联合细胞学筛查，亦可进行HPV16/18或p16/Ki67检测作为二次分流管理。近几年，甲基化标记物可用于宫颈癌筛查，研究显示，与HPV检测和p16/Ki67染色标记相比，甲基化标记物具有更高的特异性[26]。甲基化标志物在宫颈癌筛查中的应用日渐成熟也为HPV分流管理提供更多选择。

4 讨论

随着HPV与宫颈癌发生关系的明确，宫颈癌筛查手段也逐渐发生变化，逐步由HPV检测辅助细胞学检查到与细胞学的联合检查，再过度到单一HPV初筛。最初，细胞学作为宫颈癌的主要筛查手段，宫颈癌的发病率和死亡率显著下降。然而，细胞学检测的缺陷也日益凸显，细胞学检测出现敏感度低、重复性差、假阴性率高等问题。此外，细胞学是一种主观检测方法，漏诊率和假阳性率均较高，在资源落后的地区细胞学医生很难满足大范围筛查的需求。P16和Ki-67双染可以提供HPV阳性患者的分流，以及改善细胞学检测的灵敏度。研究发现，与hr-HPV DNA检测相比，P16/Ki-67双染具有更高的特异性，但敏感性较低[27]。HPV检测作为初筛方法具有稳定、自动化、高敏感性等优势。大量研究表明，HPV检测相比于其他筛查方法具有更高灵敏度和阴性预测值，并且可降低联合检测的复杂性和资源消耗[28]。然而，HPV初筛同样也存在局限性，易造成阴道镜的过度转诊，引起筛查者的恐慌。HPV非依赖性宫颈腺癌的筛查也为HPV初筛带来巨大挑战。此外，hr-HPV检测的有效性是否因年龄、性生活史等存在差异仍需要深入探讨。

一项按年龄分层比较hr-HPV初筛和细胞学筛查的研究表明，hr-HPV初筛结果显示25～35岁女性CIN3+检出率高于35岁以上女性；在25～65岁女性中，hr-HPV初筛的CIN3+检出率高于细胞学筛查[29]。另一项年龄分层资料显示25～29岁的女性检出CIN3+的5年风险最高，50～64岁的女性最低[30]。虽然30岁以下女性hr-HPV阳性结果的风险较高，但在不同年龄组之间，不同筛查方法CIN3+检测的一致性较好[29]。此外，由于20～25岁的年轻女性hr-HPV感染的持续性和进展率较低，几乎在短时间内自然消退，很少发展成CIN2阳性。2020年，美国癌症协会(ACS)筛查指南建议宫颈癌开始筛查的年龄为25岁，且HPV的一线筛查必须是FDA批准的可以用于一线筛查的HPV检测方法Cobas 4800和Onclarity。由于FDA批准的一线HPV检测方法尚未广泛在临床应用，故将联合筛查和单独细胞学检查作为可接受的筛查方案。基于以上资料，建议HPV一线初筛可以选用Cobas 4800和Onclarity；联合细胞学筛查，5种检测方法均可。此外，一项研究报告显示，在沈阳盛京医院就诊的15～30岁年龄组主要与HPV45感染有关，31～45岁年龄组与HPV33和HPV56感染有关，46～60年龄组与HPV16感染有关，HPV18在宫颈癌患者中感染率最高[31]。建议可以根据各地区流行的HPV感染型别、不同型别的多重感染等因素筛选合适的HPV检测方法，Cevista、Cobas 4800、Aptima、Onclarity均具有分型优势。宫颈病变患者HPV感染的流行病学调查及危险因素分析表明，初次性交年龄≤20岁、吸烟、流产次数＞1次是发生hr-HPV感染的独立危险因素[32]。针对以上HPV感染率高的女性，建议HPV检测联合其他方法分流管理。

5 展望

宫颈癌是目前唯一病因明确，且可防治、可筛查、可治疗的恶性肿瘤。随着宫颈癌筛查技术的不断提高，宫颈癌防治工作也取得相应进展。现有的宫颈癌筛查主要包括醋酸/碘染色肉眼观察法、细胞学检查、HPV检测、p16/Ki67双染色法等。醋酸/碘染色在欠发达地区是较为合适的筛查方法。细胞学检查和HPV检测均为宫颈癌筛查的有效手段。然而，病理医师的匮乏与技术水平不一导致细胞学检查的漏诊率和误诊率均较高。近几年，人工智能成为辅助细胞学检查的新趋势，提高了细胞学阅片的准确性与高效性，其在宫颈癌筛查中的作用还需临床资料进一步确证。2018年，批准FDA认证的hr-HPV检测应用于一线初筛，提高了筛查的敏感性。然而，与细胞学相比，hr-HPV检测导致患者转诊阴道镜的比例较高，检查结果的异常更容易造成患者的心理压力。如何平衡HPV检测的敏感性和CIN2+患者检出的特异性仍具挑战。p16/Ki67双染色法可分流hr-HPV阳性患者以及细胞学结果为ASC-US和低度鳞状上皮病变(LSIL)患者，该方法可减少阴道镜转诊率，是宫颈癌联合筛查的潜在工具。随着NGS技术应用于HPV检测，以及DNA甲基化在宫颈癌筛查中的研究，这些技术将进一步完善HPV检测，更有效地应用于宫颈癌的防治。