外泌体对缺血性卒中的作用机制及研究进展

张冬雪，邹伟

卒中是全球公共健康的高危疾病之一，具有高发病率、高死亡率、高致残率等特点，据统计，全球每年新增卒中患者约1500万，是世界第2大致死和第3大致残疾病。其中缺血性卒中（ischemic stroke，IS）是卒中的主要亚型，主要由脑大动脉闭塞导致的局灶性脑缺血引起，占所有卒中的80%左右[1-2]。对于IS的治疗，及时的血液再灌注，包括使用tPA进行超早期静脉溶栓或手术机械取栓治疗，是最直接有效的疗法[3]。但相关研究显示，tPA在血管内的溶栓作用是有益的，在脑实质内（非溶栓作用）是有害的，且tPA治疗时间窗窄，仅有4.5 h，禁忌证较多，治疗后有发生脑出血的风险，多数患者因错过最佳治疗时机，出现不同程度的后遗症[4]。找到高效又安全的疗法成为IS研究亟待解决的问题。近年来，外泌体因其独特的细胞间交流、靶向运输、内容物加工等特性受到广泛关注[5]，且外泌体内的微小核糖核酸（microRNA，miRNA/miR）作为IS的新型标志物，可促进血管生成和神经发生，抑制炎症反应和细胞凋亡。深入研究外泌体对IS后继发性神经损伤的作用有助于该病的早期诊断、治疗及预后[6-7]。本文主要介绍外泌体对IS的作用机制、防治价值以及干细胞源性外泌体的相关治疗作用，以期为该病的治疗和科学研究提供借鉴。

1 外泌体概述

外泌体是一种直径为30～150 nm的特殊细胞外囊泡[8]，1983年被首次发现[9]，1987年被正式命名为“外泌体”[10]。在研究初期，人们发现外泌体可清除细胞内某些无用的RNA片段与质膜，尤其在中枢神经系统中，外泌体充当细胞“清洁工”角色，用于给细胞减负[11]。近年来研究发现，在一定条件下，外泌体可运载蛋白质、胆固醇、DNA、RNA（mRNA、非编码RNA、miRNA）等物质，并通过质膜融合和受体-配体识别完成细胞间信号交流与传导[12]。尤其是其所含的RNA，对受体细胞有重要的调控作用[13]，其中miRNA是一类高度保守的内源性非编码小RNA，通过与靶mRNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合来阻断mRNA的转录，增加mRNA稳定性，抑制翻译和表观遗传变化，进而调控基因表达[14]。同时外泌体可将miRNA分子远距离平移转载至受体细胞，实现了细胞间高效信息交流和靶向运输[15]。此外，外泌体小而无毒，其外膜为脂质层结构，可以很容易地穿过血脑屏障而不引起免疫反应[16]，而不同源细胞的外泌体表面都携有特殊蛋白（如CD9、CD63）、热休克蛋白、参与膜融合与运输的蛋白（如GTP酶、附件蛋白）和凋亡诱导因子相互作用蛋白（apoptosis inducing factor interacting protein X，Alix）、肿瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，tsg101）等相似的保守蛋白，外膜富含神经酰胺和甘油磷脂，提高了对靶细胞的亲和性，便于被识别和分离纯化，也保证了外泌体广泛存在于生物体体液中不被降解，发挥稳定性作用[17]。正是这些特性，为外泌体治疗神经系统疾病提供了有力的基础理论支撑，使其成为介导脑损伤后特异性生物标志、靶向药物运输和神经元再生的理想选择，为外泌体治疗IS的进一步研究和临床应用提供了可能[18]。

2 外泌体与缺血性卒中

IS是临床最常见的脑血管病之一，其继发的脑损伤机制极为复杂，但多与缺血灶扩张导致炎症反应、神经元坏死、血管损伤和细胞凋亡等机制有关。研究证实，外泌体作为细胞间物质和信息的“传递员”，参与调控各种生理、病理过程，并可通过抑制以上损伤，延缓病理进程[6-7]。此外，在不同病理状态下细胞分泌的外泌体有各自的特征性作用，当脑组织缺血缺氧时，多个miRNA表达水平均发生变化，并在不同区域和时间上差异明显，可利用这些差异对比，寻找生物标志物，发掘外泌体对IS的防治价值[19]。

2.1 外泌体对缺血性卒中的作用机制

2.1.1 抑制炎症反应 免疫炎症反应是导致卒中后继发性脑损伤的重要原因之一。其中小胶质细胞是先天免疫系统的主要组成部分，是中枢神经系统中重要的固有免疫细胞，被认为是对急性脑损伤（包括脑梗死）做出反应的第1个非神经细胞[20]。急性脑损伤后，炎症反应立即触发，小胶质细胞被过度活化并表现为M1（促炎）和M2（抗炎）两种类型[21]。因而调控小胶质细胞的极化可作为抑制IS后脑损伤的治疗靶点。研究发现，小鼠脑损伤后，损伤区域内星形胶质细胞外泌体miR-873a-5p表达增加，介导细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-kB）信号通路和小胶质细胞的M1活化被抑制，促进M2型标志物精氨酸酶1（arginase 1，ARG1）、IL-4、IL-10表达，增强抗炎作用[22]。黄山[23]发现，小鼠重复创伤性脑损伤（repetitive traumatic brain injury，rTBI）后，小胶质细胞外泌体miRNA-124-3p表达增加，调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-蛋白激酶B（mammalian target of rapamycin-protein kinase B，mTORAkt）信号通路，促进小胶质细胞从M1型向M2型极化的转变，抑制rTBI后的神经炎症反应。同时M2型小胶质细胞外泌体miR-124被神经元吸收，抑制其下游泛素特异性蛋白酶14（ubiquitin-specific protease 14，USP14）表达，降低实验小鼠的脑梗死面积，促进神经功能恢复[24]。

2.1.2 促进神经元再生与突触重塑 由于脑组织对缺血缺氧的耐受性极差，当脑血管破裂或相应供血动脉阻塞后，大脑神经元很快发生不可逆性损伤甚至坏死。研究表明外泌体miRNA可调控神经轴突的增殖和分化，促进神经元再生与突触重塑[25-26]。Meng等[25]通过双荧光素酶报告分析证实，细胞癌基因c-Fos为miR-181c的靶基因，IS后外泌体miR-181c表达下调，c-Fos基因表达增加，同时激活活化蛋白-1（activator protein-1，AP-1）和活化T细胞核因子c1（nuclear factor of activated T-cells cytplasmic 1，NFATc1）等下游基因，提高脑组织对缺血缺氧损伤的耐受性，进而保护神经元细胞。在体外实验中，E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，Zeb2）/轴抑制蛋白（axis inhibition protein 2，Axin2）可刺激内源性神经发生，诱导卒中后神经功能恢复，在大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型中，富含Zeb2/Axin2的外泌体可下调性别决定区盒基因10（sex determining region Y-box 10，SOX10）、内皮素-3和Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）表达，增强神经干细胞的增殖和分化，促进脑室下区、海马区、皮质区神经元再生以及神经生长因子表达上调，改善MCAO大鼠神经可塑性，而在缺血边界区，富含Zeb2/Axin2的外泌体可逆转缺血损伤引起的轴突缺失，促进突触重塑和增殖[26]。

2.1.3 促进血管新生 IS发生后，局部血供破坏，脑组织缺血乏氧，导致血管通透性改变等一系列连锁反应，加重脑组织损伤。内皮细胞来源于内皮祖细胞，是构成血管系统的基本单位，内皮细胞的增殖和分化是血管生成的重要环节。研究发现，大鼠脑梗死模型建立12 h后，梗死区域内内皮细胞开始增殖，3 d后缺血半暗带区域血管密度增加，循环内皮祖细胞释放的外泌体miR-296转移到受体内皮细胞，促进血管生成[27-28]。此外，内皮细胞外泌体miR-210是促进血管生成和神经生成的关键因子，与局部血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平升高相关，miR-210的上调是内皮细胞对缺氧反应的关键反馈，可直接影响内皮细胞生存、迁移和分化[29]。实验证实，在缺氧条件下，miR-210表达增加，促进内皮细胞增殖和血管新生，提示miR-210可能是IS治疗的潜在靶点[30]。而在大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）模型中，miR-17-92富集的外泌体可显著改善大鼠感觉、运动功能，促进内源性血管新生[31]。

2.1.4 抑制细胞凋亡 研究表明，细胞凋亡广泛参与IS的发病机制，来自不同细胞的外泌体可抑制缺血模型中的细胞凋亡和神经元死亡，在IS病程中具有明显的神经保护潜能[32]。Deng等[33]发现，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白2（lipocalin 2，LCN2）表达增高可介导神经元死亡和脑损伤，而外泌体miR-138-5p是LCN2的负调控因子，在氧-葡萄糖剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）诱导的星形胶质细胞中，过表达的miR-138-5p可通过抑制LCN2表达下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate protease 3，caspase-3）和B细胞淋巴瘤/白血病2基因相关X蛋白（B cell lymphoma/leukemia 2 gene associated X protein，Bax）的水平，上调Bcl-2水平，抑制星形胶质细胞的凋亡，减少缺血后的神经元损伤。此外，在缺血模型中，外泌体miR-22-3p能结合并抑制赖氨酸特异性去甲基化酶6B（lysine-specific demethylase 6B，KDM6B）表达，并通过KDM6B/骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/Bcl-2修饰因子（Bcl-2 modifying factor，BMF）轴发挥抗凋亡作用[34]。内皮细胞来源的外泌体可抑制caspase-3、Bax的表达水平，上调Bcl-2的表达水平，保护神经细胞免受缺血再灌注损伤[35]。

2.2 外泌体对缺血性卒中的防治价值

2.2.1 早期诊断 临床过程中，在卒中溶栓时间窗内区分TIA和IS极为困难，早期诊断对疾病的治疗和预后尤为重要。Ji等[36]发现，急性期IS患者血清外泌体miR-9和miR-12水平明显高于健康人，且与卒中评分和血清IL-6含量呈正相关，其相关系数分别为0.7126、0.6825和0.6980、0.6550，提示外泌体miR-9和miR-12是急性期IS诊断和严重程度评估的潜在标志物。Li等[37]检测不同缺血时长大鼠脑脊液和血浆中趋势一致的外泌体miRNA含量，结果显示，缺血10 min大鼠血浆外泌体rno-miR-122-5p水平较其他组明显下调，缺血5 min大鼠血浆外泌体rno-miR-300-3p水平显著高于其余各组，且血浆和脑脊液中这些miRNA的水平是相关的，提示外泌体rno-miR-122-5p和rno-miR-300-3p可能是TIA血源性的生物标志物。除此之外，血浆miR-21-5p、miR-30a-5p和miR-223等对IS的诊断也有重要价值[38-39]。

2.2.2 临床分期 Li等[40]采用反转录聚合酶链反应（reverse trans-criptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测55例IS患者和25名健康对照者血浆外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p的水平，通过构建ROC曲线评估miR在IS分期中的诊断准确性，结果显示，与健康对照组相比较时，亚急性期两种miRNA的AUC分别为0.971和0.889；急性期AUC分别为0.769和0.423；在急性期与亚急性期表达比较时，miR-422a的AUC为0.957，miR-125b-2-3p的AUC为0.769。可见血浆外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p可作为IS患者的血液生物标志物，其中miR-422a的诊断价值更高，这两种miRNA的联合使用可能是确定急性与亚急性IS分期的有力手段。

2.2.3 靶向治疗 研究显示，基因靶向治疗是治疗IS的理想疗法，外泌体含有源代细胞的特异性miRNA，是体内基因靶向运输的天然载体[41]。Gherardini等[42]发现，卒中后星形胶质细胞增生产生的硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sul-fate proteoglycan，CSPG）可抑制神经元轴突再生。在MCAO大鼠模型中，皮质神经元miR-17-92过表达簇富集的外泌体可靶向抑制磷酸酶和张力素同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因的表达，增加PTEN下游蛋白的磷酸化，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进皮质神经元轴突生长与缺血边界区的神经突触重塑，改善神经功能，克服了CSPG的抑制作用[43]。在小鼠脑缺血再灌注实验中，外泌体miR-451a可以靶向抑制Ras相关的C3肉毒素底物1（Ras related c3 botulinum toxin substrate 1，Rac1），减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，提高缺血再灌注后神经细胞的存活率[44]。

2.2.4 预后评估 Wang等[45]通过临床高通量测序筛选分析卒中患者血清外泌体中的独特miRNA，发现miR-328-3p上调时会加重脑缺血再灌注损伤，证明miR-328-3p对IS的短期预后具有重要的预测作用。在急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血液中，外泌体miR-134表达量显著高于健康对照组，且高表达的外泌体miR-134水平与患者NIHSS评分、梗死体积、IL-6和血浆hs-CRP含量呈正相关，其相关系数分别为0.6079、0.7841、0.6936和0.6207，在预后较差的卒中患者中miR-134峰度较高（mRS＞2分），提示外泌体miR-134可能是区分AIS与非卒中的关键因素，是评估AIS预后的新型标志物[46]。

3 干细胞源性外泌体对缺血性卒中的治疗作用

近年来，干细胞移植治疗IS取得了较好的效果[47]，最初的目的是用干细胞替换丢失或损伤的组织，经过不断深入研究发现，干细胞可通过分泌外泌体促进受损脑组织重塑和血管新生，恢复神经功能，而无须考虑干细胞移植可能带来的免疫排异反应等不良反应。其中，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）源性与神经干细胞（neural stem cells，NSC）源性外泌体研究最为广泛。

3.1 间充质干细胞源性外泌体 目前已知可分泌外泌体的细胞类型中，MSC是最高产的一类细胞，在动物疾病模型中，MSC源性外泌体（MSC-exos）具有治疗作用并表现出免疫抑制活性，且其质量和数量不会因MSC永生化而打折扣[48]。研究表明，MSC移植作为IS的辅助治疗方法，其作用仅次于溶栓治疗[49]，然而MSC并没有被整合到原有的神经网络中，而是通过释放外泌体间接改善脑神经损伤，诱导神经再生。Shabbir等[50]发现，内化的MSC-exos可促进成纤维细胞增殖和迁移，诱导血管内皮细胞管状分化，同时激活Akt、ERK和信号转导与转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等多条信号通路，诱导多种生长因子（如神经生长因子）表达增加，促进血管愈合与新生，且内皮细胞和新生血管数量与MSC-exos的浓度有明显的剂量依赖性，进一步证实MSC-exos在IS治疗中的重要作用。

3.2 神经干细胞源性外泌体 既往研究证实，NSC是仅存在于神经系统的特殊类型的干细胞，可塑性极强，可直接分化为神经元，具有补偿内源性神经细胞不足和改善细胞生存炎症微环境的能力[51]。基于旁观者效应（如神经保护、免疫调节），NSC源性外泌体（NSC-exos）可克服细胞移植治疗中的免疫反应或排异等风险，被成功内吞入细胞内[52]，减少大鼠神经元凋亡，抑制小胶质细胞激活和神经炎症[53]。因此，作为神经系统的天然种子资源，且NSC的无细胞治疗是一种新的治疗策略，NSC-exos在IS治疗中发挥着重要作用[54]。研究表明，NSC-exos含有与神经再生、神经保护和神经可塑性相关的miRNA和蛋白，并可作为独立的代谢单位，改变环境中关键营养物质的浓度，影响周围细胞的生理功能，抑制IS后脑组织水肿，保持脑白质的完整性[55]。同时NSC还可以被干扰素γ正向诱导，产生变异外泌体，增强NSC-exos促细胞增殖和抗凋亡作用，突出了NSC-exos的重要作用和巨大前景[56]。

4 不足与展望

当前，改善脑组织的缺血再灌注损伤仍然是IS治疗的重点和难点，外泌体能够穿越血脑屏障，且自身结构稳定，耐受性强，具有携带、运输特异性“货物”，完成细胞间信息传递和靶向运输的作用，启发了外泌体载药疗法的发展，推动了IS治疗方法的多样化。但外泌体研究尚处于初级阶段，仍有不足之处：①在现有的外泌体治疗IS的研究中，多以观察性实验为主，如何调控外泌体的释放和内容物的“分拣”，以及外泌体在大脑中的迁移和归巢能力仍未被研究。②由于外泌体体积极小、定量方式不一，难以进行严格的分离、纯化和计算给药剂量。③临床中靶向能力不足、体内半衰期短、有效载荷不足等弊端也限制了外泌体载药疗法的应用。④是否有哪些因子或通路在卒中后介导或激发相关细胞释放外泌体，以及如何诱导、修饰外泌体，增强其正向作用，仍然是外泌体研究的热点。因此，在接下来的研究中，应在现有的理论和机制研究基础上，针对以上问题进行深入探索与研究。

综上所述，外泌体通过参与IS的病理过程发挥作用，是调节IS后继发性脑损伤的重要环节。虽然目前外泌体在IS领域的相关研究还不完善，但其发现对于提高IS后神经细胞存活率和改善患者预后具有重要作用。进一步探讨外泌体的作用与转归，探析其治疗靶点及调控机制，对于防治IS后继发性神经功能损伤具有长远的临床意义。

【点睛】脑组织缺血再灌注损伤是IS治疗的重点和难点，外泌体及其内含的microRNA作为IS的新型标志物，可促进血管生成和神经发生，抑制炎症反应与细胞凋亡，对IS的早期诊断、治疗及预后具有积极作用。