血浆神经酰胺与血管性事件相关性的meta分析

杨程缘，金奥铭，许杰，孟霞

心、脑血管疾病分别为全球致死病因的第1位和第2位[1]。合并高血压、脂代谢紊乱、糖尿病、既往心脑血管疾病病史等危险因素可使血管性事件的风险进一步增高[2]。因此，探索针对性预测心、脑血管事件发生风险的新型生物标志物迫在眉睫。

神经酰胺（ceramide，Cer）作为鞘脂的中间代谢产物，可介导细胞凋亡[3]，有基础研究表明，Cer可通过介导细胞凋亡参与心、脑血管疾病的病理生理过程[4]。目前已有临床研究将以Cer为基础建立的神经酰胺测试2（ceramide test 2，CERT2）评分应用于心血管性死亡的预测[5-6]。最新一项meta分析说明CERT2评分还可用于评估不良心血管事件的发生风险[7]。然而，CERT2评分内的特定Cer组分是否与不良心血管事件发生风险相关，CERT2评分是否也可有效预测单独的心、脑血管事件，目前尚无明确结论。本研究旨在通过meta分析评估CERT2评分内的特定Cer组分与不良心血管事件发生风险之间的相关性，以及CERT2评分与心肌梗死、卒中发生风险之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 文献检索 计算机系统性检索PubMed、Embase、Library、Web of Science、中国知网、万方和维普数据库。检索时限从建库至2021年10月，收集涉及Cer与不良心血管事件、心肌梗死、卒中相关性的文献。中文检索策略：“神经酰胺”和（“心血管事件”或“心肌梗死”或“心梗”或“冠心病”或“脑梗死”或“缺血性脑卒中”或“脑血管闭塞”或“脑血栓”或“脑梗塞”或“缺血性中风”或“中风”或“缺血性脑血管病”或“脑栓塞”或“缺血性脑病”或“卒中”“缺血性卒中”）。英文检索策略：（ceramides[Mesh] OR ceramides[allfields]）AND（cardiovascular disease[Mesh]OR cardiovascular disease[all fields]OR myocardial infarction[Mesh] OR myocardial infarction[all fields] OR stroke[Mesh] OR brain infarction[Mesh]OR stroke[all fields] OR cerebrovascular accident[all fields] OR infarct[all fields]OR infarction[all fields] OR brain infarct[all fields] OR brain infarction[all fields]）。根据系统分析和meta分析优先报告的条目（preferred reporting items for systematic review and meta-analysis，PRISMA）和流行病学观察性研究的meta分析（meta-analysis of observational studies in epidemiology，MOOSE）报告规范，本研究执行meta分析和研究结果报告标准。

纳入标准：①研究类型为观察性研究；②针对存在心血管疾病风险因素患者，分析血浆Cer与不良心血管事件或心肌梗死或卒中发生风险的相关性的研究。排除标准：①摘要、病例报告、综述、信件、社论、方案、动物或细胞研究、未发表的结果或信息以及随机对照试验；②不能直接或间接提供不同Cer组分，包括Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）或CERT2评分与不良心血管事件或心肌梗死或卒中发生风险RR或HR及其95%CI数据的研究；③重复发表的研究结果；④非随机干预研究偏移风险评估工具（risk of bias in non-randomised studies of interventions，ROBINS-I）评估为中等偏倚风险等级以上的研究。

1.2 文献筛选与方法学质量评价 根据入排标准，两名研究人员独立审查检索所得的文献标题和摘要，并获取论文全文，进行文献筛选。如意见不一致，则与第三方会商确定。对所有符合标准的研究，提取第一作者、发表年份、研究时间、研究类型、样本量、研究人群特征、随访时长、研究终点和混杂因素等相关信息。

ROBINS-I是为非随机干预性研究设计的偏倚风险评估工具，本研究利用ROBINS-I进行文献质量评价[8]。该评价工具包括7个评价领域，分为干预前（混杂偏倚和研究对象选择偏倚）、干预中（干预分类偏倚）和干预后（偏离既定干预偏倚、缺失数据偏倚、结局测量偏倚、结果选择性报告偏倚）3个部分。评估者对相应领域的偏倚风险按照事先制定的标准给出“低、中、高、极高或不清楚”的风险评估。最终综合单个领域的评估结果对研究的“整体偏倚”风险作出评价。

1.3 CERT评分和神经酰胺组分 CERT2评分由4种组分组成，包括3种不同的Cer组分、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）及其比值：Cer（d18∶1/24：1）/Cer（d18∶1/24∶0）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（16∶0/22∶5）、Cer（d18∶1/16∶0）/PC（14∶0/22∶6）、PC（16∶0/16∶0）。总分根据上述组分的四分位数计算，范围是0～12分。根据总分将个体分为4个风险等级：0～3分为低风险，4～6分为中风险，7～8分为高风险，9～12分为极高风险。

本研究分别对CERT2包含的3种特定Cer组分——Cer（d18∶1/16∶0）、Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）与不良心血管事件发生风险的相关性，以及CERT2评分与心肌梗死或卒中发生风险的相关性进行meta分析。

1.4 统计学方法 应用STATA 15.1软件进行统计学分析。3种特定Cer组分和CERT2评分均为连续变量，研究报告其HR及95%CI。用Q检验和I2进行异质性检验并评估纳入研究的异质性。当P＞0.1，I2＜50%，采用固定效应模型计算合并效应HR，反之采用随机效应模型。meta分析时进行了多因素校正，校正变量包括临床特征和实验室指标。

2 结果

2.1 文献检索结果、研究一般特征及质量评价共检索到5837篇相关文献，剔除重复文献2002篇和阅读标题、摘要后发现的不符合入排标准的文献3678篇。通过对剩余157篇文献进行通读全文，去除不合格文献151篇，最终纳入6篇文献（7项研究），共覆盖30 886例患者。所有纳入研究的整体偏倚风险为“中风险”，即纳入的观察研究都被认为是非随机研究的可靠证据，但与设计良好的随机试验不等同。文献筛选流程和纳入的研究基本特征分别见图1和表1。

表1 纳入研究基本特征

图1 文献筛选流程及结果

2.2 神经酰胺检测方法 Carvalho等[9]的研究利用亲水性相互作用LC（HILIC色谱柱）MS/MS定量检测患者血浆Cer组分，使用Agilent 1260 LC系统和Agilent 6430三重四极质谱仪（Agilent科技公司，加利福尼亚州圣克拉拉）在HILIC色谱柱（马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司）（100×2.1 mm；粒径2.6 mm）上分离提取的脂质。Yin等[10]的研究

采用超高效液相色谱-使用配备ESI探针并与安捷伦1290 infinity LC系统（安捷伦，加利福尼亚州帕洛阿尔托）连接的AB Sciex四极质谱仪6500（马萨诸塞州弗雷明翰市Sciex）对血浆Cer进行串联质谱分析。Mundra等[11]的研究使用同样的Cer检测策略，使用安捷伦1290液相色谱系统和安捷伦6490三重四极质谱仪，通过液相色谱和电喷雾电离串联质谱进行血浆Cer分析。Gence等[12]和Hilvo等[5，13]的研究收集患者血浆样本后，代谢组学分析在配备超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）（日本京都岛津Nexera-X2）的混合三重四极杆/线性离子阱质谱仪（QTRAP 5500，AB Sciex，Concord，Canada）上进行。PC与Cer来自相同的纸质提取物并进行分析。

2.3 特定神经酰胺组分与不良心血管事件关系meta分析结果 特定Cer组分与不良心血管事件风险的关系：共纳入4项研究（3篇文献）[9-11]，包括11 004例患者，其中发生不良心血管事件的患者2154例。Mundra等[11]的文献涉及2项研究。Cer（d18∶1/16∶0）的异质性检验显示I2=87.0%，P＜0.001，采用随机效应模型，结果显示Cer（d18∶1/16∶0）为不良心血管事件的独立危险因素（HR1.13，95%CI1.02～1.24，P=0.013）。Cer（d18∶1/24∶0）的异质性检验显示I2=67.6%，P=0.026，采用随机效应模型，结果显示Cer（d18∶1/24∶0）不是不良心血管事件的独立危险因素（HR0.97，95%CI0.90～1.03，P=0.295）。Cer（d18∶1/24∶1）的异质性检验显示I2=55.5%，P=0.081，采用随机效应模型，结果显示Cer（d18∶1/24∶1）不是不良心血管事件的危险因素（HR1.05，95%CI0.99～1.10，P=0.081）（图2）。

图2 特定神经酰胺组分与不良心血管事件关系的meta分析

2.4 CERT2评分与单独卒中或心肌梗死关系meta分析结果 CERT2评分与卒中或心肌梗死发生风险的关系分析共纳入3项研究（3篇文献）[5，12-13]，包括19 882例患者。CERT2评分与卒中关系研究的异质性检验显示I2=64.1%，P=0.062，采用随机效应模型，结果显示CERT2评分不是卒中的独立危险因素（HR1.19，95%CI0.98～1.43，P=0.075）；CERT2评分与心肌梗死关系研究的异质性检验显示I2=85.3%，P=0.001，采用随机效应模型，结果显示CERT2评分不是心肌梗死的独立危险因素（HR1.10，95%CI0.95～1.29，P=0.209）（图3）。

图3 CERT2评分与单独卒中或心肌梗死关系meta分析

3 讨论

本研究通过分析已发表的血浆Cer与不良心血管事件或心肌梗死或卒中关系的观察性研究，对CERT2评分内的特定Cer组分是否均与不良心血管事件发生风险相关，CERT2评分是否能够针对性预测心、脑血管事件的发生这两个待解决问题进行了探索。研究结果提示CERT2评分内的Cer（d18∶1/16∶0）组分是不良心血管事件发生的危险因素，而Cer（d18∶1/24∶0）和Cer（d18∶1/24∶1）与不良心血管事件之间无显著相关性，另外，CERT2评分本身与单独卒中或心肌梗死风险也无显著相关性。

Cer属于鞘脂代谢中间产物的一种，是构成细胞膜、外泌体等质膜的重要成分，并作为第2信使参与炎症和氧化应激反应。动物实验提示，Cer可能参与了卒中的病理生理过程。Nakane等[14]观察到沙土鼠的海马在脑缺血再灌注5 min、30 min和24 h时Cer水平显著升高，鞘磷脂水平显著降低。大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）可导致大鼠大脑皮层Cer水平升高[15-16]。在自发性高血压大鼠中，MCAO之前进行短暂缺血预处理可显著降低缺血区及周围区域的Cer水平[16]。在缺血性卒中的小鼠模型中，神经磷脂酶活性的减弱可显著减少脑组织损伤[17]。在一项模拟缺血性心脏病的细胞实验中，通过RNA转染和单细胞测序技术，使用特定Cer酶阻滞剂和RNA转染调控缺氧状态下小鼠心肌细胞Cer酶表达水平，进而控制Cer水平。实验综合分析转录组学数据、Cer酶和Cer水平，得出上调Cer酶表达水平可通过水解抵消缺血性损伤后Cer异常增高带来的负面影响，促进心肌细胞存活，从而起到心肌保护作用的结论[18]。除此之外，使用能够降低Cer水平的药物可以防止载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）基因敲除小鼠动脉粥样硬化病变的形成[18]。

血浆Cer作为心、脑血管事件发生风险分层的生物标志物的潜力已经得到了越来越多的关注。既往研究关于含有C16∶0、C24∶0、C24∶1酰基链之一的Cer组分和不良心、脑血管事件的相关性结果并不一致。一方面，综合其他涉及Cer与不良心血管事件相关性但未纳入本次分析的研究来看[19-21]，含有C16∶0或C24∶1酰基链的Cer组分更倾向于是不良心血管事件的危险因素，而C24∶0与不良心血管事件发生无关或只有较弱相关性，这与我们的meta分析结果部分一致。另一方面，综合脑血管病领域内有限的研究报道，C16∶0、C24∶0倾向于是卒中发生的危险因素[20-22]。部分研究提示C24∶1与卒中发生正相关。但最近发表的一项对比急性缺血性卒中和无脑血管病对照组的研究中，C24∶1是唯一在缺血性卒中急性期水平降低的Cer组分，并且随着距离发病时间的增加其水平进一步降低，这与其他研究结果相反[23]。由此可见，C24∶0、C24∶1酰基链与心血管疾病的关系可能不同于其与脑血管疾病的关系。CERT2评分包含C16∶0、C24∶0、C24∶1酰基链的特定Cer组分，既往有研究显示每标准差增量的CERT2评分对应患者发生不良心血管结局风险升高20%[7]，而本研究未见CERT2评分与卒中之间存在显著相关性。尽管前期关于Cer与心、脑血管疾病的相关性研究数量有限，部分还受到小样本量和横断面研究设计的限制，但C24∶0、C24∶1与心脑血管疾病的不同关系可能解释CERT2可以作为预测心血管事件的指标，但不能有效预测卒中结局，也进一步说明Cer在心血管领域内的研究结果并不能完全外推至脑血管病领域。本研究结果还显示CERT2与单独心肌梗死事件并无显著相关性，提示CERT2并不能特异性预测心肌梗死的风险。未来需要高质量的临床研究进一步探索卒中、心肌梗死特异性Cer的预测模型。

目前将血浆Cer应用于卒中发生风险预测的临床数据十分有限，并且很多受样本量小和横断面研究设计的限制，本研究的优势是采用ROBINS-I工具对非随机干预性研究进行质量评价，在保证纳入研究质量的前提下，综合而成样本量大、随访时间长、有足够的统计学效应来定量分析特定血浆Cer组分水平、Cer评分与血管性事件发生风险之间相关性的数据。未来需要补充Cer针对性应用于卒中和缺血性心脏病的相关数据，可探索Cer与不同血管性疾病亚型之间的关系，并进一步明确在疾病发病机制中起主导作用的特定Cer组分种类及其内在的作用通路。

【点睛】本研究是首篇针对CERT2评分的Cer组分及评分本身与不良心脑血管事件相关性进行的meta分析，结果显示，CERT2评分本身不能反映卒中或心肌梗死的风险，但部分Cer组分与不良心血管事件风险升高有关。