蜜蜂微孢子虫病防控方法研究进展

程 尚，吴浩东，任 勤，甘磊，王庆华

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.重庆市畜牧技术推广总站，重庆 401121；3.西南大学动物医学院，重庆 荣昌 402460）

蜜蜂是多种虫媒植物（虫媒植物的重要特点是花色艳丽、有花蜜，花朵有香味）的重要传粉媒介，对提高很多农作物（如油菜）的质量和产量和有重要意义，而且蜜蜂能为人类提供高质量的蜂产品，有助于解决“三农问题”，对于农民脱贫和实现共同富裕具有重大的经济效益和社会效益。但近些年来，世界范围内蜜蜂总种群数量却在持续下降[1]，在导致蜂群损失的众多因素中，微孢子虫病是制约全球蜂群健康发展的一个重要因素。

1 蜜蜂微孢子虫病概述

蜜蜂微孢子虫病是危害养蜂业的一种重要疾病，这是一种感染性的消化道疾病[2]，导致蜜蜂腹泻、蜂群采集能力和繁育能力下降，甚至导致整个蜂群的崩溃，出现蜂群崩溃失调症(colony collapse disorder，简称CCD)，其病因往往是东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）和（或）西方蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）的单独感染和混合感染。最新的研究表明微孢子虫属于真菌界，蜜蜂微孢子虫归属微孢子虫科（Nosematidae）微孢子虫属（Nosema），在自然界长期进化为高度特化的单细胞寄生真菌[3]。

早在1909 年德国科学家就在西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂群中首次检测到了蜜蜂微孢子虫[4-6]，东方蜜蜂微孢子虫的虫体第一次在蜜蜂体内被发现是在1996年[7]，随后在2006 年的西班牙，东方蜜蜂微孢子虫的虫体在西方蜜蜂（A.melllifera）体内也被发现，确认了东方蜜蜂微孢子虫既可以感染东方蜜蜂也可以感染西方蜜蜂[8]。

蜜蜂的中肠上皮细胞是蜜蜂微孢子虫的定殖部位，它们通过极管将孢子注入宿主细胞内[9]，吸收利用蜜蜂肠道的营养生长繁殖，在细胞质中发育成为其不同的生长形态，其形态也从最初的圆形很快转变为纺锤体的状态，在其发育的最初72 h 后就可以检测到初生孢子，初生孢子此时的形态为圆形，96 h 后可以检测到成熟孢子，此时的孢子一般为椭圆形，本病以孢子的形式在蜂群中传播[10]。蜜蜂微孢子虫从蜜蜂中肠中夺取了大量能量物质，破坏了其正常摄取能量的能力，导致蜜蜂肠道上皮细胞坏死脱落，蜜蜂出现下痢、萎靡、极度虚弱成为“爬蜂”[11]。被感染的蜜蜂会出现早熟现象，在恶劣天气条件下外出觅食和出现盗蜂现象，甚至最终出现整群蜜蜂死亡崩溃[12]。

2 蜜蜂微孢子虫病的流行病学和危害

据报道，发现蜜蜂微孢子虫可以适应各种各样的生态气候，呈全球性分布，而且能感染几乎所有种类的蜜蜂[13]。蜜蜂微孢子虫感染的季节性规律是比较明显的：夏季感染水平较低，秋天到达低峰，冬季感染数量缓慢上升，春季感染率最高。据调查，东方蜜蜂微孢子虫比西方蜜蜂微孢子虫分布更广、危害更大[7,14]，东方蜜蜂微孢子虫在绝大部分的中国西方蜜蜂群中都存在[15]，其感染率高达98.5%[16]。其他实验表明，相比较于西方蜜蜂微孢子虫，东方蜜蜂微孢子虫在长期的进化过程中，出现了对高热的环境更耐受的进化结果[6]，因此这可能就是东方蜜蜂微孢子虫能够在世界范围广泛传播的原因之一[17]。

由于蜜蜂是群居动物，其具有互相照料的生物学特性，即交哺的特征，这促进了疾病在蜂群中的传播[18]，除了在蜂群内部中相互感染外，蜜蜂的采集、交配排泄等行为可能会导致疾病在蜂群间的传播。病蜂的排泄物、分泌物则会污染蜂粮和水源，比如采水行为会污染水源、采集粉蜜行为会污染蜜粉源。交配行为会传播孢子给其他的雄蜂和蜂王。有实验证明，蜜蜂微孢子虫还可以垂直传播，Roberts 等在雄蜂的精液中检测到了微孢子虫，而蜂王则可能通过注入感染了微孢子虫的雄蜂精液而受到感染[19]。在自然条件下蜜蜂的幼虫期和蛹期未发现被感染，但Eiri 等在实验室条件下成功感染了蜜蜂幼虫，表明了蜜蜂幼虫也能够被感染[20]。

3 蜜蜂微孢子虫病的控制方法

3.1 烟曲霉素

早在1952 年，烟曲霉素对蜜蜂微孢子虫病的预防和治疗作用就被发现了，并在临床上大规模应用其防治蜜蜂微孢子虫病，取得了良好的预防和治疗效果。研究发现每群使用10～50 mg 低剂量水平的烟曲霉素可有效预防蜜蜂孢子虫病[21]，但长期低剂量使用会对蜜蜂微孢子虫的感染丧失预防作用，而且还会干扰蜜蜂中肠组织的生理机能，导致蜂群大面积死亡[22]。但大剂量使用烟曲霉素治疗微孢子虫病时，易导致蜜蜂中毒死亡，其中毒机制是烟曲霉素通过与一种重要的修饰酶即蛋氨酸氨肽酶2（MetAP2）结合抑制其正常生理功能的表达[23]。几乎所有真核生物都有MetAP1 和MetAP2 2 种亚型，烟曲霉素在蜜蜂体内的作用靶点是MetAP2[24]。由于真核生物的MetAP2 蛋白基因有很高的同源性[25]，因而烟曲霉素可能会对人和其他动物有潜在的危害[22]。正因如此烟曲霉素的应用受到极大的限制，首先由于抗生素残留问题，烟曲霉素已被欧盟禁用，只有北美少数几个国家允许使用该药物用于治疗蜜蜂微孢子虫病且只能在非流蜜期使用，而我国尚无相关规定。如果长期使用也会造成病原的抗生素耐受问题。

3.2 天然提取物

天然提取物对蜜蜂微孢子虫感染的影响已得到广泛研究。因为利用天然提取物来预防和治疗蜜蜂微孢子虫病的方法与其他药剂相比，具有毒性低和无残留的优点。Yemor 等人评估了乙醇蜂胶提取物发现，在感染后第二天和第四天饲喂蜂胶提取物可提高受感染蜜蜂的存活率、减少孢子量并降低感染率，但难以逆转持续8 天或更长的感染的影响[26]。这表明，蜂胶的提取物可以在一定程度上治疗蜜蜂微孢子虫的早期感染。但蜂胶的化学成分复杂，受蜜蜂种类、采集植物种类、地理条件、季节等的影响很大，目前的研究将蜂胶中的有效物质指向其中所含有的多酚、酚醛和酮类物质[27]。

还有一些植物提取物也显示出一定的治疗效果，如大黄和黄连煎水、大蒜汁与1%的醋酸1∶2 混合、川楝子与使君子的水提取物等，使用这些植物提取物与糖浆混合饲喂蜜蜂可以减轻蜜蜂感染的症状，也可用于预防[11]。有报道称，给蜜蜂饲喂天然提取物（栎树皮提取物），可使病蜂的中肠肠腔形成密实的保护层（单宁层）[28]，实验结果发现天然提取物栎树皮提取物可以有效降低蜜蜂微孢子虫的感染率[29]。另外在其他的天然提取物抗蜜蜂微孢子虫实验中发现，天然植物提取物白藜芦醇和百里酚也有一定的抗蜜蜂微孢子虫效果[30,31]。

3.3 RNA 干扰

利用RNA 干扰技术来进行基因敲除的方法已被广泛用于控制害虫数量、控制昆虫病原性疾病和研究特定基因在许多昆虫物种中的功能作用。蜜蜂微孢子虫通过极管穿透宿主细胞的细胞膜将孢子注入到宿主细胞内，构成极管的重要蛋白是富含脯氨酸的极管蛋白1 和富含赖氨酸的极管蛋白2 以及分子量大于135 kDa的极管蛋白3[10]。Rodríguez-García 等以蜜蜂微孢子虫的极管蛋白3 为靶基因，饲喂极管蛋白3 区域所对应的dsRNA，可以使感染东方蜜蜂微孢子虫的蜜蜂在处理后的第10 d，极管蛋白3 表达下调，蜜蜂体内微孢子虫的载量明显降低，而与免疫相关的Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin 和defensin-14 个基因表达发生上调[32]。研究表明，Wnt 通路对昆虫Toll 通路上免疫基因的表达具有抑制作用。Li 等通过沉默蜜蜂裸露角质层基因(naked cuticle)的表达，进而降低了宿主体内东方蜜蜂微孢子虫的载量，延长了蜜蜂寿命[27,33]。这一结果表明，沉默宿主nkd 基因的表达可以激活宿主的免疫反应抑制东方蜜蜂微孢子虫的繁殖，改善蜜蜂的整体健康状况。

4 蜜蜂微孢子虫病的预防方法

4.1 使用器具消毒方法降低蜜蜂微孢子虫病的交叉感染

蜜蜂微孢子虫病的传播途径是通过被病蜂粪便污染的饲料、巢脾、蜂具传播。因此切断蜜蜂孢子虫的传播途径尤为重要，采用熏蒸消毒被病蜂粪便污染的饲料、巢脾、蜂具是比较理想的办法。常用的有甲醛-高锰酸钾熏蒸法和酸性消毒剂（过氧乙酸、盐酸、草酸、除垢剂、柠檬酸、醋酸等）溶液消毒器具消毒法。甲醛-高锰酸钾熏蒸法进行器具消毒的原理是甲醛-高锰酸钾在一起快速左右进而快速地释放出甲醛气体，经过一定时间杀死病原微生物，它是器具消毒常用而且高效的一种消毒方法，使用方法是使用高浓度的甲醛(往往是38%的甲醛)和高锰酸钾进行等比例混合，用胶条密封一天以上，即可杀死蜜蜂微孢子虫的孢子。酸溶液消毒法常用的是甲酸、过氧乙酸和（或）醋酸溶液进行器具消毒，器具消毒的方法是将酸溶液喷洒在蜂箱内，密封1～2 天即可杀死蜂箱内的蜜蜂微孢子虫孢子[34]，消毒后打开蜂箱，待蜂箱内酸味散尽即完成了器具消毒[35]。

4.2 使用发酵的酸饲料杀灭饲料中的蜜蜂微孢子虫孢子

采食了被病蜂粪便污染的饲料是最常见的传染途径，也就是所谓的“病从口入”。因此采用发酵和改变饲料的pH 值来杀灭饲料中的蜜蜂微孢子虫孢子的一个重要的方法。发酵饲料大多是酸性饲料，是使用有益菌如枯草芽孢杆菌(有氧发酵)、酵母菌(无氧发酵)或乳酸菌(厌氧发酵) 发酵处理蜂花粉、豆粕等蜜蜂饲料，使用有益菌发酵产酸的过程中不仅去除了蜜蜂微孢子虫的孢子，而且产生了乳酸和其他酸性食物，适口性强，营养丰富，蜜蜂喜欢取食，蜂群的采集能力和繁育能力大大提高。另外，也有研究报道利用蜜蜂微孢子虫在酸性环境下不利于蜜蜂微孢子虫孢子萌发的特点，可以通过饲喂其他酸性物质（如柠檬酸、醋酸或草酸等）改变蜜蜂肠道酸碱环境，除了增加蜜蜂采食的适口性，而且在早春蜜蜂微孢子虫病大爆发的季节饲喂蜂群，可以起到一定的控制微孢子虫病的作用，在一定程度上降低蜜蜂微孢子虫感染率[14]。如一般在糖浆中添加柠檬酸、醋酸或草酸等酸性产品制成酸性饲料[35]。

4.3 选育优良的抗蜜蜂微孢子虫病的蜂群

实践证明，选育优良的抗蜜蜂微孢子虫病的品种是防治蜜蜂微孢子虫病最经济、最有效的途径。另外，选择性繁殖、更换蜂王等蜂群管理手段对蜂群的多发性疾病具有很好地预防和缓解作用。通过人工选育的方法，培育出对微孢子虫感染具有抗性或耐性的蜂种，以降低微孢子虫的危害是有可能的。据报道，在丹麦通过20 多年的选育，已经培育出一种对东方蜜蜂微孢子虫具有抗性的蜂种[36]。另外，重庆师范大学许金山蜂学研究团队、云南农业大学蜂学研究团队和重庆畜牧科学院蜜蜂所等多个部门已经培育出优良的抗病品种，为蜜蜂微孢子虫病的防控打下坚实的基础。

4.4 通过饲喂有益微生物来拮抗肠道中蜜蜂微孢子虫的繁殖

有益菌群（如枯草芽孢杆菌、酵母菌或乳酸菌等）的繁殖通过抑制致病菌（如蜜蜂微孢子虫的孢子）的繁殖，降低了蜜蜂微孢子虫的感染率。肠道微生物与生物体共生共存，达到二者之间微妙的平衡关系，它们不仅能够协助宿主吸收营养物质、降解有害物质，而且在宿主的免疫系统的构成和功能方面也有重要作用。另外，肠道中有益菌群的代谢产物可能还具有抗菌活性[29]。有报道称用乳酸菌作为饲料添加剂对东方蜜蜂微孢子的感染具有抑制作用[37]，进一步的研究发现，可能是由于某些芽孢杆菌属和肠球菌属的细菌所分泌的细菌素的作用[38]。蜜蜂正常的肠道菌群有助于抵御外来病原的入侵，而肠道菌群受到许多因素的干扰，如环境、药物（包括抗生素和农药等）、饮食等[39]，因此在日常的饲养管理中应尽量维持这种共生平衡，增强蜜蜂抵抗力达到预防疾病的效果。

5 展望

蜜蜂微孢子虫病对养蜂业危害巨大，制约了全球养蜂业的发展，在蜜蜂采集和繁殖旺盛的季节会导致繁育力严重下降和蜂产品减产，蜂群早衰、内勤蜂哺育能力下降，甚至导致蜂群崩溃，是蜂群崩溃失调症的最常见原因之一。在现阶段，人们已从一般的病原学特点、临床特征、诊断方法进行了研究，下一步将在分子生物学方面对蜜蜂微孢子虫病的感染机制和防控药物进行研究。在防治方法上也经历了更新迭代，从单纯使用抗生素治疗到利用天然提取物、肠道微生物、RNA 干扰及育种技术等对蜜蜂微孢子虫病进行预防和治疗。本实验室针对本病研制的药物具有很好地预防和治疗效果，下一步将在小范围试验的基础上推广使用。对于广大蜂农来说，在生产实践中仍应以预防为主，从根源上杜绝本病的发生。随着对本病感染机制研究的深入，和新开发的防控药物的逐渐应用，相信能为今后更好开发防控本病的方法和有效的药物提供重要的参考。