趋化素样因子MARVEL 跨膜结构域家族成员4/6作为程序性死亡受体配体1调节因子的研究进展△

袁萌钰，郭志娟

内蒙古医科大学附属人民医院病理科，内蒙古 010020

肿瘤作为人类最重要的死亡原因，一直是医学领域需要攻克的难题。目前，人们已经研究出多种方法抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的毒性并加强免疫监测功能。针对程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称 PD-1）/程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）轴的抗体药物为肿瘤治疗提供了一种很有前途的免疫疗法。免疫治疗是通过增强和刺激自身免疫反应破坏肿瘤细胞。研究表明，肿瘤细胞和其他免疫浸润细胞中PD-L1的表达较为常见[1]。肿瘤细胞可以促进PD-L1向效应T细胞传递抑制信号，从而抑制抗肿瘤免疫[2]。针对PD-1/PD-L1轴的抑制剂可以抑制肿瘤生长，延长患者生存期。应用PD-L1抑制剂治疗的过程中肿瘤细胞会出现复发、转移和化疗耐药性，因此PD-L1抑制剂治疗的有效率较低，这给恶性肿瘤患者的预后带来巨大挑战。PD-L1抑制剂疗法的有效率低是一个需要克服的关键问题[3-4]。研究表明，以PD-L1为突破口，联合靶向治疗可能会成为提高临床疗效和患者生存期的有效方法[5]。本文主要分析了趋化素样因子MARVEL跨膜结构域家族（CKLF like MARVEL transmembrane domain containing family，CMTM）在多种肿瘤中的研究进展，主要涉及CMTM6和CMTM4在肿瘤中的表达、潜在功能及其与多种肿瘤细胞表面PD-L1的相关性，并分析了CMTM在胃癌中的研究进展。

1 CMTM和PD-L1

在细胞表面的所有蛋白中，只有少量的高置信度蛋白与CMTM6相互作用，其中PD-L1排名最靠前。针对PD-L1免疫治疗，研究者发现了两条潜在的途径——CMTM6和CMTM4，它们被认为是PD-L1调节因子，可以维持抗肿瘤免疫[6]。

1.1 PD-L1与免疫逃逸

PD-1（CD279）是在激活的T细胞和B细胞表面表达的负性调控因子，其单体存在于细胞表面，具有共用配体PD-L1（B7-H1或CD274）和程序性死亡受体配体2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也 称 PD-L2）（B7-DC 或 CD273）[7]。PD-L1作为免疫抑制分子，可以通过各种复杂的信号通路抑制T细胞的活性，逐步减弱抗原特异性免疫反应，诱发抗肿瘤T细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞再生[8-11]。当免疫系统受到破坏时，淋巴细胞上的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，向T细胞传递一种负向调节信号，诱导T细胞进入静息状态，抑制T细胞增殖，使其无法识别肿瘤细胞，导致肿瘤细胞无限制地生长。然而这种促进肿瘤细胞生长的过程是可逆的，使用抗PD-1或PD-L1抗体抑制PD-1/PD-L1通路可以恢复效应T细胞的活性[12-13]。因此，抑制PD-L1途径的治疗性抗体可能会具有临床益处并提高患者的总生存率。

1.2 CMTM 概述

随着对CMTM家族研究的不断深入，研究者发现CMTM蛋白控制着恶性肿瘤发展的关键生物学过程，包括生长因子受体的激活和再循环、细胞增殖、凋亡、转移和免疫逃逸[2]。CMTM是一个新的基因家族，由9个基因组成，包括CKLF和CMTM1～CMTM8[2]。不同CMTM基因的染色体位置 各 不 相 同 ：CMTM1～CMTM4（ 染 色 体 16q）、CMTM5（染色体 14q11.2）和 CMTM6～CMTM8（染色体3p22.3），同时这些位置存在关键的肿瘤抑制基因[14]。CMTM成员在人体组织中广泛表达，涉及多个生物系统，如免疫系统、男性生殖系统、造血系统、循环系统和骨骼肌肉系统等[15]。通过深入的研究发现CMTM蛋白不仅在上述多个系统中发挥重要的生物学作用，而且与多种恶性肿瘤有关，涉及肿瘤的发生、发展和转移。CMTM6是位于染色体3p22.3的CMTM家族成员，是一种普遍表达的3型跨膜蛋白，该蛋白在许多正常组织中广泛表达，与PD-L1共定位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质。CMTM4是CMTM中最保守的成员，由CMTM4-v1、CMTM4-v2和CMTM4-v3三种转录变异体组成。CMTM4-v1和CMTM4-v2是CMTM4的主要形式，在人体多种组织中广泛表达，而CMTM4-v3只存在于某些肾脏和胎盘组织中[16]。

1.3 CMTM6、CMTM4调控PD-L1

CMTM6和PD-L1表达的相关性是基于免疫组织化学和由癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库获得的RNA测序数据确定的。免疫组织化学结果显示，CMTM6和PD-L1的表达呈正相关（r=0.342，P=0.044）[9]。对人类肿瘤细胞株的研究表明，CMTM6是PD-L1蛋白的关键调节因子[17]。CMTM6通过阻止PD-L1在溶酶体中的降解来维持PD-L1在细胞表面的表达[18]。另外，STIP1同源性和含U框蛋白1（STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1）是一种E3泛素连接酶，被认为是PD-L1的负性调控因子。在敲减CMTM6的肿瘤细胞中，继续敲减STUB1后PD-L1水平高于未敲减STUB1的肿瘤细胞[6]，即STUB1缺失会导致肿瘤细胞中PD-L1水平增加，这意味着CMTM6可能通过STUB1调控肿瘤细胞表面PD-L1的表达。CMTM6缺失后可通过减少PD-L1的表达增强肿瘤特异性T细胞反应，因此CMTM6不仅作为参与PD-1/PD-L1轴的关键分子受到关注，而且作为潜在的恶性肿瘤治疗靶点受到关注[18]。CMTM6缺失导致PD-L1蛋白水平显著降低，但不影响其转录水平。研究表明，主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ和PD-L2水平不受CMTM6抑制的显著影响，表明虽然CMTM6可在蛋白水平上调节PD-L1，但它不是蛋白质翻译或稳定性的一般调节因子[19]。CMTM4是与CMTM6密切相关的CMTM成员，与CMTM4具有55%的氨基酸同源性，在CMTM6缺失的情况下也被认为是PD-L1的正性调控因子，并且没有其他CMTM成员参与[18]。

为了研究CMTM6是否具有维持PD-L1表达并调节抗肿瘤免疫的作用，Burr等[20]采用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术去除表达外源抗原鸡卵蛋白（ovalbumin，OVA）的小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的CMTM6，以增强肿瘤的免疫原性，结果显示，与未去除CMTM6的小鼠相比，CMTM6缺失导致细胞表面PD-L1的表达下调，且T细胞的活性增强，小鼠存活率显著提高。总之，体外人类数据和体内小鼠数据表明，CMTM6通过调节细胞表面PD-L1的表达，在T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥关键的调节作用。

研究表明，两条潜在的途径（CMTM6和CMTM4）对于优化免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）治疗至关重要[21]。然而，目前关于胃癌中CMTM6或CMTM4的报道相对较少，它们与PD-L1的关系还需要进一步研究。

2 CMTM6、CMTM4与多种肿瘤细胞表面PD-L1的相关性

CMTM6是各种类型恶性肿瘤细胞表面PD-L1表达的主要调节因子，帮助各种类型的恶性肿瘤细胞参与免疫逃逸。CMTM4作为CMTM6的备用调节因子，也会参与各种类型恶性肿瘤的免疫逃逸，但效率低于CMTM6[1]。

2.1 CMTM6与肿瘤

研究者在未分化多形性肉瘤（undifferentiated pleomorphic sarcoma，USP）中发现，所有PD-L1高表达的肿瘤细胞均持续表达CMTM6，表明CMTM6与PD-L1的表达显著相关，尤其与PD-L1的强表达密切相关[6]。另有研究者在肝细胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）中建立了CMTM6敲除的人类HCC细胞系，以评估CMTM6对免疫调节和肿瘤生存能力的作用，结果发现CMTM6表达与PD-L1表达和HCC中的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）渗透呈正相关[22]。在另一项有关HCC的研究中，研究者将患者分为药物治疗管理（medication therapy management，MTM）和非MTM HCC亚型，MTM型肿瘤中PD-L1表达和炎性细胞密度均高于非MTM型肿瘤。在整个HCC患者群体和MTM HCC患者群体中，CMTM6高表达与更短的总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease-free survival，DFS）显著相关。此外，CMTM6/PD-L1共表达的MTM HCC患者发生HCC进展和死亡的风险更高[23]。大规模队列研究发现，CMTM6/PD-L1共表达与HCC患者的临床预后密切相关。CMTM6与PD-L1联合检测对肝癌患者的免疫检查点选择具有一定的参考价值[24]。生物信息学分析显示，大肠癌中CMTM6与PD-L1的表达呈正相关[25]。另一方面，一些研究表明CMTM6的高表达与胶质瘤和胃癌的预后不良有关[26-27]。

2.2 CMTM4与肿瘤

CMTM4在CMTM6基因缺陷的HAP1细胞中发挥替代功能，因此CMTM4经常被下调并作为肿瘤抑制因子。此外，通过在CMTM6基因缺陷细胞中进行单倍体基因修饰筛选和遗传互补实验，证明了CMTM6稳定肿瘤细胞表面PD-L1表达的这个功能与其最接近的家族成员CMTM4共享，但并不是所有其他被测试的CMTM成员都具有此功能[28]。CMTM4免疫染色主要分布在肿瘤细胞和异型增生细胞的细胞膜上。Li等[2]验证了CMTM4在人和小鼠头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）标本及HNSCC细胞株中高表达。CMTM4同时也参与了上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程、肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）样特性和PD-L1的表达，小干扰RNA可通过下调CMTM4基因表达抑制EMT，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。CMTM4基因敲除可通过蛋白激酶B途径减少CSC相关标志物。CMTM4沉默可降低γ干扰素诱导的人非小细胞肺癌细胞中PD-L1的表达。结构性PD-L1在CMTM4基因敲除后没有改变，这一结果表明CMTM4是PD-L1表达的备用调节因子[28]。

2.3 CMTM6、CMTM4与肿瘤

有关研究已确定CMTM6、CMTM4是CMTM家族中关系最密切的两个成员[6]。Zhao等[28]对肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）患者进行分组，确定了3种具有不同临床和免疫特征的免疫分子亚型（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型），Ⅱ型和Ⅲ型RCC患者可能对抗PD-1/PD-L1治疗以及免疫疗法组合更敏感，Ⅰ型RCC中CMTM4的高表达（69%）与CMTM6的表达具有显著相互作用，说明CMTM6、CMTM4可能是Ⅰ型RCC新的治疗靶点。Takeuchi等[29]首次鉴定了CMTM6和CMTM4基因序列，从一项犬实验中得出CMTM6和CMTM4与人和小鼠的氨基酸序列同源性较高。犬的恶性黑色素瘤和骨肉瘤中同时表达CMTM6、CMTM4和PD-L1。通过RNA干扰下调CMTM6和CMTM4基因表达可显著降低犬细胞系中PD-L1在细胞表面的表达。表明CMTM6和CMTM4可能是犬中PD-L1调控的关键分子。

3 胃癌中CMTM的表达

在胃癌中，CMTM6和PD-L1主要表达于胃癌细胞的细胞膜和细胞核。在恶性肿瘤患者中CMTM6高表达，因此它有可能指导胃癌的PD-1/PD-L1治疗[30]。研究表明，CMTM4较高水平表达与胃癌患者良好的OS、无进展生存期（progressionfree survival，PFS）有关，表明CMTM4可能是预测胃癌预后的重要生物标志物；CMTM6和PD-L1高表达与Borrmann型（P＜0.001）、N分期（P=0.002）、腹膜转移（P=0.007）和TNM分期（P=0.038）有关，胃癌组织中CMTM6和PD-L1的表达呈正相关（r=0.260，P＜0.01）；与CMTM6低表达的胃癌患者相比，CMTM6高表达的胃癌患者能够获得更好的OS和PFS[31]。Liang等[31]同时研究了CMTM基因在胃癌中的预后作用，该研究对CMTM基因表达模式进行了无监督层次聚类分析。结果显示，与正常胃组织相比，胃癌组织中CMTM1/3/6/7/8 mRNA水平均上调，而胃癌组织和正常胃组织中CMTM2/4/5 mRNA水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同CMTM的mRNA表达与胃癌患者的肿瘤分期、肿瘤分级、淋巴结转移状态等临床特征均具有较强的相关性。此外，结果显示，CMTM3/5 mRNA水平升高与患者的PFS、进展后生存期和OS较差有关（P＜0.05）。相反，CMTM2/4/6 mRNA水平升高与更好的OS、进展后生存期和PFS显著相关。表明CMTM家族的表达模式可能是胃癌患者的一个新的预后因素。CMTM可能作为一种新的预后分子或免疫治疗胃癌的选择。

4 小结

随着对胃癌免疫逃逸机制中PD-L1的深入研究，研究者发现抑制PD-L1的表达是提高抗肿瘤免疫反应至关重要的一步。鉴于PD-L1在免疫治疗中的应用价值，研究调节PD-L1表达的不同因子，可能会影响免疫治疗疗效，将有助于恶性肿瘤患者的个性化临床管理。此外，临床试验中应探索一些与ICI具有协同效应的潜在因子。此外，CMTM4作为CMTM6的备用调节因子，是否也参与了信号通路，CMTM的其他成员是否也受PD-L1以及信号通路的调节均需要进一步研究。因此，有必要进一步探索CMTM在胃癌中的表达、分子机制及相关信号通路。CMTM家族将有望为胃癌的诊断和治疗提供新的方案，其与PD-L1的联合治疗值得期待。