DNA甲基化调控年龄相关性白内障的研究进展

张高波，崔亭松，郑贵倩，刘善贺，胡姗姗

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院眼科，黑龙江 牡丹江 157011)

Wadding在1939年提出“表观遗传”这一概念，引入了“表观遗传景观”，用来描述将遗传特征转化为可视化表型的分子和生物学机制，涵盖了基因型和表型的概念[1]。目前，表观遗传学主要的调控机制是DNA甲基化沉默基因的表达，DNA甲基化可以改变DNA分子的活性，而不改变碱基序列。通过一组DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmts)催化DNA来影响基因活性，发挥重要的生物学功能[2]。年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)是由晶状体浑浊导致的全球首位致盲性眼病，发病机制尚未明确，与遗传和环境的交互作用密切相关。研究表明，ARC除了与一些基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)相关，晶状体相关基因的DNA甲基化对它的发病机制也起到重要作用[3]。为了对进一步研究奠定基础，本文就近年来DNA甲基化在ARC的发病机制中的作用进行综述。

1 DNA甲基化

对于哺乳动物而言，DNA甲基化是指在Dnmts的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作为甲基(-CH3)供体，将甲基基团选择性地转移并添加到CpG(Cytosine-phosphate-Guanine,CpG)二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上的过程，变成5-甲基胞嘧啶。这是一个非常重要的表观遗传修饰事件，DNA甲基化修饰可以改变DNA分子的活性，而不改变基因的碱基序列。以此来调节基因的表达，即甲基化去除之后就像基因解开封印，用完之后通过甲基化再封印起来。并且影响许多关键过程，例如基因组印记和转录调控等[4]。

CpG岛是指CpG二核苷酸位于并富集在一个集群，即富含CG序列的区域，存在于大多数哺乳动物的启动子区，是DNA发生甲基化的位置。CpG里的C是DNA四种碱基之中的胞嘧啶的缩写，p代表磷酸，G是碱基鸟嘌呤。CpG岛的长度要大于500bp，CG含量超过55%，CpG比值大于0.65。人类基因组大概有4万个CpG岛，大部分位于启动子区域，研究一个基因启动子DNA甲基化就是找CpG岛的位置，启动子CpG岛甲基化之后会诱发基因沉默，启动子CpG岛甲基化与转录活性呈负相关[5]。

DNA甲基化是可逆的酶促反应，目前已知哺乳动物的DNA甲基转移酶有6种：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L。根据结构和功能上的差异分为：维持甲基化和从头甲基化。DNMT1主要起维持甲基化的作用，它使仅有1条链甲基化的DNA双链完全甲基化，参与DNA复制双链中新合成子链的的甲基化；DNMT3A和DNMT3B主要负责从头甲基化，即是指对DNA链甲基化状态的重构，不依赖与DNA双链的复制过程，是在完全非甲基化的位点上添加甲基基团，使未甲基化的DNA变成甲基化状态的DNA[6]。

目前，在癌症的研究中表明，某些肿瘤抑癌基因的失活是由于启动子区域内的高甲基化导致的，原癌基因的激活则相反；在不同类型的癌症中，几乎都发现全身广泛的基因被DNA甲基化沉默。DNA甲基化与去甲基化过程是动态可逆的，以此来沉默和激活基因。因此，针对DNA甲基化状态改变为靶点的疾病治疗方法有重大研究价值。

2 年龄相关性白内障

ARC由晶状体混浊导致的全球首位致盲性眼病，据估计全球有1600万人受到影响[2]。患病率和发病率都在较高水平，存在年龄、性别、地区、受教育程度和种族等差异，同时ARC是导致中老年人住院的最常见眼病[7]。环境因素和遗传因素是其共同的致病因素，与衰老密切相关，随着世界人口的增长和老龄化加剧，ARC的患病率正在逐年上升[8]。目前，ARC的具体发病原因尚不明确，由活性氧(active oxygen species,ROS)介导的氧化应激被认为是ARC发病的主要启动因素。而且，年龄相关性白内障治疗手段单一，以手术治疗为主，但是手术治疗的并发症严重，是目前困扰年龄相关性白内障治疗的主要难题；同时手术治疗水平也参差不齐，也是影响手术治疗效果的重要因素[2,7]。为了找到治疗和预防ARC的更多新途径，近年来针对年龄相关性白内障的表观遗传学研究也在积极开展。

3 年龄相关性白内障中相关基因的甲基化

3.1 ARC相关基因的甲基化测序近年来，晶状体相关基因的甲基化状态改变与白内障的发病机制研究成为探索疾病机制的新途径。You等[9]对3只白内障大熊猫和3只健康大熊猫进行了全基因组甲基化测序，分别鉴定出两组之间的116和242个差异甲基化基因(Differentially Methylated Genes,DMG)。进一步的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和GO(Gene Ontology,GO)富集分析确定了110个差异甲基化基因，其中EEA1、GARS、SLITRK4、GSTM3、CASP3和EGLN3在内的6种DMG与ARC有关。该研究对象是大型哺乳动物，分析结果对于人类ARC的研究也有重要意义。Wang[10]等收集了50岁以上ARC患者的晶状体前囊膜样品，进行甲基化微阵列分析，并且通过高通量测序方法鉴定甲基化基因。和对照组相比，发现843个位点甲基化，其中包括802个高甲基化位点和542个对应基因，41个去甲基化位点和29个对应基因。筛选出一些与ARC相关的基因，代表性基因有COL4A1、GJA3和SIPA1L3[10]。DNA甲基化微阵列对差异甲基化基因的有效筛选，对这些基因在ARC中的进一步研究意义重大。Wang等[11]研究调查了ARC患者晶状体上皮细胞(Lens Epithelial Cells,LECs)中DNA甲基化和转录抑制相关基因的表达谱。通过微阵列分析评估基因的表达水平；通过定量实时PCR(qRT-PCR)和Western印迹分析进一步证实了结果，与对照相比，ARC患者的LECs中5种基因(DNMT3B、HDAC1、HDAC4、HDAC9和MBD3)的mRNA和蛋白质水平增加，该研究为LECs中的表观遗传修饰与ARC的形成提供了依据[8]。

3.2 DNA损伤修复相关基因虽然ARC的发病机制并未明确，但是氧化损伤导致的DNA双链破坏，所介导的细胞凋亡是主要原因。而且DNA损伤和DNA修复功能异常被认为是ARC的发病机理，LECs的DNA损伤修复基因功能是否完整与ARC的发生密切相关[12-13]。Li等[12]调查了ARC患者LECs中DNA修复基因的表达水平，并且检测了基因差异化表达是否与基因启动子区域的DNA甲基化改变相关。通过qRT-PCR和亚硫酸氢盐特异性PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)，确定了差异表达基因的DNA甲基化水平，与对照组相比，ARC患者的LECs中10个DNA修复基因的mRNA水平降低；而1个DNA修复基因表达水平升高，其中MGMT基因的启动子区域在ARC组织中被高度甲基化，参与调节该基因的表达，并影响ARC的形成，该研究证实了DNA修复基因对于维持晶状体透明性的重要作用，修复基因的改变与ARC的发病有关[8]。

8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)是碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)途径中含的一种修复蛋白[14]。Wang等[14]选取临床病例ARC患者和对照组各15例15眼，与对照组相比，发现OGG1第一外显子中的CpG岛在ARC晶状体DNA中显示出高度甲基化，OGG1在晶状体皮质中mRNA和蛋白表达水平明显降低，免疫荧光显示OGG1阳性细胞比例明显降低。发现OGG1表达降低与ARC晶状体皮质中的OGG1的CpG岛的甲基化有关，而且用5-氮杂-20脱氧胞苷(5-aza-20 deoxycytidine,5-AZA -DC)诱导人晶状体上皮细胞B-3(human lens epithelial cell B-3,HLEB-3)去甲基化可上调OGG1的表达[14]。

WRN(Werner综合征基因)是一种DNA修复基因[15]。Zhu等研究了WRN启动子甲基化水平与ARC患者晶状体中基因表达水平的关系，选取了117例ARC患者和39例非ARC患者为对照，与对照组相比，ARC患者前晶状体囊中的WRN表达明显降低，ARC患者前晶状体囊中的WRN启动子的CpG岛显示出高甲基化。因此，WRN启动子中的高甲基化，降低了晶状体细胞DNA修复能力，调控ARC的形成[15]。此外，DNA甲基化调控的WRN通过ATM/p53信号通路抑制LECs的凋亡和氧化应激，WRN受到异常甲基化调控时，会影响ARC的发生[16]。Jiang等发现在ARC患者的晶状体前囊组织中，WRN被下调，WRN启动子区的甲基化水平升高。研究表明WRN过表达和5-AZA -DC去甲基化作用，通过抑制ATM/p53信号通路，可以增强LECs的增值并能抑制其凋亡和氧化应激；WRN的过表达还能消除氯喹激活的P53凋亡通路的作用，当WRN被抑制时，则起到相反的作用[16]。

这些研究表面DNA修复基因的表观遗传修饰与ARC的发生机理相关。目前，对于DNA损伤修复基因的表观修饰与ARC的关系研究，主要是检测基因启动子区的CpG岛甲基化水平改变，具体的调控机制还有待进一步研究。

3.3 氧化平衡系统相关基因氧化应激和抗氧化系统的失效是导致晶状体氧化损伤的主要因素。ARC的发生与氧化应激相关，而白内障相关的氧化应激相关基因的全基因组筛选尚未得到彻底研究[17]。

αA-晶状体蛋白(CRYAA)的伴侣状活性对维持晶状体透明性必不可少。Liu等[18]的研究分析CRYAA甲基化修饰的潜在机制，首先预测CRYAA启动子CpG岛的转录因子结合位点，再分析CpG位点甲基化对转录因子的影响，又用不同阶梯浓度的Zebularine和不同的给药时间来处理HLEB-3细胞。发现了CRYAA启动子的低甲基化抑制转录因子Sp1的DNA结合能力，导致CRYAA在HLECs中的表达下降，Zebularine治疗通过剂量依赖性和时间依赖性的方式恢复CRYAA在HLECs中的水平[18]。未来，DNA甲基化可能提供CRYAA的靶向治疗，减轻ARC患者中晶状体的浑浊程度。

人LECs中存在核因子-类胡萝卜素2-相关因子2(Nuclear factor-carotenoid2 related factor 2,Nrf2)，一种针对应激的具有细胞保护作用的核转录因子，Nrf2可以激活近600个细胞保护性靶基因[19]。凯尔奇样相关蛋白1(Keap1)是一种氧传感器蛋白，通过蛋白酶体降解来调节Nrf2的水平；过表达的Keap1会降低Nrf2的水平，从而导致细胞内氧化还原失衡，丧失晶状体细胞抗氧化保护功能[19]。Gao等[17]研究不同年龄组的人晶状体中Nrf2/Keap1的蛋白质水平和基因表达及基因启动子区的CpG岛的甲基化状态。结果显示Keap1启动子区的去甲基化上调了Keap1蛋白的表达，从而增加了Nrf2的降解，导致Nrf2下游抗氧化酶的转录活性受到抑制，最终导致该抗氧化系统失衡，形成ARC[17]。另一些研究也证明，由于Keap1基因启动子区的CpG岛的去甲基化，同时也还发现该去甲基化过程是由于激活DNA脱甲基途径酶(Tet1)导致，最终使过表达的Keap1降低了Nrf2的水平，从而废除依赖于Nrf2的抗氧化剂保护。

3.4 抗衰老相关基因衰老是与年龄有关眼病的主要危险因素，尤其是ARC的发生与衰老关系密切。Klotho基因是抗衰老基因，表达水平与年龄密切相关，其编码的Klotho蛋白可能在哺乳动物中起到抗衰老作用，影响与年龄有关的疾病。Jin等[20]通过对青年正常人，中年ARC患者和老年ARC患者各30例分3组，分别进行了Klotho基因RT-PCR，免疫组化染色，甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP )检测。研究首次发现Klotho基因在正常人晶体上皮细胞有表达，且青年组表达呈强阳性(100%)，中年组弱阳性(36.7%)，老年组阴性(0%)；Klotho基因在老年人群中甲基化程度高(93.3%)，在中年组中弱甲基化(56.7%)。可以发现mRNA及蛋白的表达均随着年龄增加而下降，而Klotho启动子区CpG岛甲基化程度随年龄增加而增加，且该启动子区的超甲基化会导致Klotho基因沉默以及Klotho蛋白的表达下调或无表达，最终影响ARC的形成。

4 总结与展望

目前的研究可以证明DNA甲基化水平是ARC发生的重要影响力量，将来需要更全面地探索DNA甲基化修饰的完整范围。ARC是由环境风险因素和遗传风险因素共同引起的[8]。DNA甲基化与环境和衰老的变化关系密切，通过DNA甲基化改变影响基因表达，而基因表达变化为疾病的发展或进程奠定了基础。目前，已在疾病中鉴定出与ARC有关的潜在DNA甲基化位点。然而，对该疾病产生作用的所有的DNA甲基化位点及位点之间的内在联系仍需要深入探索。尽管已证明DNMTs抑制剂在癌症中特别有效，但这些药物尚未应用于包括白内障在内的人类眼科疾病。将来，更深入的研究需要集中于ARC的早期生物标记物和新的治疗靶点。