间充质干细胞及相关衍生治疗方法促进心肌梗死后心肌修复

2022-11-21杨天云王长谦

国际心血管病杂志 2022年3期

杨天云王长谦

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）发病率高，溶栓、经皮冠状动脉介入术和冠状动脉旁路移植术已明显改善了心肌梗死的死亡率，但这些方法仍无法逆转已经坏死的心肌，不能从根本上改善心脏功能。

细胞疗法是基于将自体或同种异体干细胞输送到受伤心脏中的新型治疗方法。目前，多种干细胞类型包括胚胎干细胞（ESC）、造血干细胞（HSC）、诱导多能干细胞（iPSC）和间充质干细胞（MSC）已用于心肌梗死的细胞疗法[1]。在不同类型的干细胞和祖细胞中，对MSC 的研究最为深入。MSC 为中胚层来源的多能干细胞，可以衍生自多种组织，包括骨髓、脂肪、肌肉和滑膜组织[2]。

MSC 治疗改善心功能的主要机制包括：（1）移植的MSC 可以分泌大量细胞因子及旁分泌因子对抗炎性反应，在受损可逆的心肌细胞中激活细胞保护通路[3-4]，阻止纤维化及左心室重构[1]，刺激留存的心脏干细胞（CSC）增殖、分化[5-6]。（2）移植的MSC 可以分化为内皮细胞及平滑肌细胞，促进血管生成。（3）移植的MSC 可能分化为心肌细胞[1]。

1 MSC治疗的作用

1.1 MSC的抗炎作用

MSC 可以通过旁分泌机制抑制炎性反应。研究表明，外泌体可由骨髓MSC 生成，在缺血性损伤后刺激血管新生，抑制炎性反应并改善心脏功能[7]。在急性心肌梗死后，心脏中主要存在2 种巨噬细胞亚型。M1 型巨噬细胞具有促炎作用并能释放白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α 和γ 干扰素（IFN-γ）；M2 型巨噬细胞具有抗炎作用，促进血管生成及疤痕组织形成。MSC 可增强巨噬细胞向M2 型巨噬细胞的转化，从而抑制心肌梗死后的促炎状态[8]。

1.2 MSC的抗纤维化作用

发生心肌梗死后，梗死区心肌细胞死亡，并被成纤维细胞替代，心室重构可引起心力衰竭，导致心血管死亡。细胞外基质（ECM）重构在调节心肌细胞的迁移、分化和再生中起着重要作用，基质金属蛋白酶（MMP）可维持ECM 稳态。干细胞可通过调节MMP 和MMP 抑制剂，抑制成纤维细胞活化，减少胶原蛋白和其他ECM 的沉积，从而减少左室重构，改善心肌梗死后心脏功能[9]。研究证明，体外培养的MSC 发挥抗纤维化功能依赖于肝实质细胞因子（HGF）的作用[10]。

1.3 MSC的促血管生成作用

血管生成对于梗死心肌的功能恢复有着重要意义。MSC 可以通过以下4 种方式促进血管生成：（1）释放生长因子和细胞因子；（2）分化为内皮细胞；（3）分化为血管平滑肌细胞；（4）作为血管周细胞发挥作用。

移植到梗死周围区的MSC 可以释放大量旁分泌因子，如血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1），这些细胞因子参与调节血管生成[9]。MSC 还可以传递囊泡和微囊泡至梗死区域，这些囊泡内含VEGF、碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素，在血管形成相关的细胞信号转导中具有重要作用[11-12]。MSC 移植可在缺血情况下显著增加存活心肌的毛细血管床密度。

1.4 MSC刺激内源性CSC增殖分化

MSC 移植后是否能分化为心肌细胞并具有相应功能具有颇多争议，而MSC 刺激内源性CSC 的增殖分化则更受认可。Hatzistergos 等[5]在猪的心肌缺血模型中将异体骨髓源性MSC 经心内膜注射到梗死区域，结果显示心脏内源性c-Kit＋干细胞增加了20 倍，有丝分裂的CSC 增加了4 倍。

2 MSC治疗存在的问题

2.1 MSC移植、存活及分化

与MSC 的细胞效应相比，植入MSC 的存活和分化率相对较低。研究发现，单纯移植骨髓MSC，细胞死亡率可高达（52.4 ± 4.8）%[13]。这可能是由于心肌梗死后MSC 的移植区处于缺氧缺血、高氧化应激水平、高炎性反应水平的微环境中。除了较高的移植细胞死亡率，MSC 移植的可操作性也较差。在结扎左前降支（LAD）动脉后，给予小鼠人胎盘来源的羊膜间充质干细胞（AMC），小鼠心脏未显示出植入干细胞的免疫组织学证据[14]。在猪急性心肌梗死模型中，将自体骨髓来源的MSC移植到缺血心肌中，注射后第三周可检测到移植部位MSC，但第十周则未能检测到[15]，这提示移植MSC 难以长时间存活。植入的MSC 分化为心肌细胞的可能性低。在狗慢性缺血性心肌病模型的心肌内注射MSC，移植的细胞可表达内皮细胞和平滑肌细胞的标志物，但未能发现心肌细胞分化的证据[16]。

2.2 MSC移植安全性

基于MSC 的心血管疾病治疗方法，已被临床前研究[5]及部分临床研究[17]证明了其短期的安全性。从年轻且健康的供体获得同种异体MSC，可以很大程度上排除衰老及异常微环境的影响，且具有与自体细胞相似的安全性[17]。然而，目前尚未对长期安全性进行深入研究。

3 MSC相关组织工程

常规方法制备MSC 及心肌内注射存在多种缺陷。首先，使用胰蛋白酶使MSC 从胶原蛋白表面脱落会引起ECM 的部分降解及细胞间联系的损失，进而诱发细胞凋亡；其次，将MSC 悬浮液进行心肌内注射的操作本身就会造成MSC 损伤，导致递送效率低下；最后，将MSC 注射在心肌梗死周围区这种离散的给药方式不可避免地引起MSC 分布不均[18]。因此，近年来很多研究者希望借助组织工程的手段避免这些缺陷。

3.1 MSC球体

MSC 球体是多个MSC 不借助其他物质结合的一种形式。Lee 等将人脐带血来源的MSC 组成的球体，在大鼠左前降支结扎3 d 后注射入大鼠心肌，结果显示该MSC 球体能够显著改善大鼠心肌收缩力并防止左室扩张。另一种由MSC 装配的3D 微组织已在体外展现了强大的存活能力以及ECM 的形成能力，这可能会成为心脏治疗的递送工具[20]。

3.2 仿生支架及基质

仿生支架及基质是另一类保存、递送、释放MSC 的平台，目前的研究多将支架或基质植入梗死区域的心肌表面。在对鼠急性心肌梗死模型的研究中，已有多种装载MSC 的生物支架或类似基质被植入心脏中并有不同程度的获益，如装载MSC 的聚电解质复合物支架可改善左室射血分数（LVEF）、促进血管新生，减缓疤痕形成及左心室扩张[21]。装载MSC 的可生物降解纳米纤维心脏贴片移植到梗死区域心外膜上，可使MSC 向梗死区域迁移并起到改善左室扩张、减少纤维化、促血管生成等作用[22]。在小鼠心肌梗死模型中使用血浆包被的装载MSC 的聚ε-己内酯（PCL）移植物可以稳定心脏功能，减轻心脏扩张，在心肌梗死后4 周，植入心脏贴片组的LVEF 只降低了6%，而假手术组和无贴片植入组分别降低了13%和20%[23]。

3.3 脱细胞化和再细胞化

脱细胞化是通过使用洗涤剂，从组织或器官中去除细胞，并保留ECM 组成、结构和生物活性的过程，将该过程与干细胞再细胞化相结合，可以作为心脏再生医学的重要生物工程工具[24]。已有研究尝试了人类心肌ECM 片的脱细胞化，后续可进行特定细胞的种植[25]。大多数心脏领域脱细胞/再细胞化的研究集中于心脏瓣膜方面，心肌梗死治疗相关的应用有待更多探索。

4 MSC疗法衍生的脱细胞生物活性蛋白制剂

4.1 脱细胞脂肪活性物质主要成分

MSC 旁分泌作用是其治疗潜力的关键部分之一，Yu 等[26]发现人体脂肪中除含有脂肪MSC，还含有大量生长因子，该团队研究了相关提取方法，并将这些生长因子定义为脱细胞脂肪活性物质（CEFFE）。酶联免疫反应检测证实CEFFE 中富含胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、VEGF、肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等多种与组织再生修复相关的活性因子。虽然TGF-β 可诱导心脏成纤维细胞介导的纤维化和心肌重构过程，但是这个过程可被bFGF 抑制[27]。在大鼠心肌梗死模型中，向心肌梗死区及梗死周围区递送bFGF 能起到减轻心肌纤维化的作用[28]。运动训练减轻心肌梗死后心功能减退的机制研究显示，运动训练能增加成熟的BDNF，BDNF-酪氨酸激酶受体B（TrkB）信号通路可能是潜在的治疗靶标[29]。

4.2 CEFFE制备方法

从吸脂手术获得脂肪抽吸物，用盐水冲洗脂肪抽吸物以去除红细胞，然后以1 200 g 离心3 min。第一次离心后，将上层油性液和下层液丢弃，收集中层脂肪并进行机械乳化。将乳化的脂肪在－80 ℃下冷冻，并在37 ℃下解冻，以进一步破坏脂肪组织。将脂肪再次以1 200 g 离心5 min，第二次离心后，产物分为4 层，将上层的油液、第二层的脂肪和第四层的杂物丢弃，小心地吸出第三层，灭菌并去除细胞碎片，制得最终提取物。将脂肪提取物储存在－20 ℃，以便将来使用[26]。

4.3 CEFFE的应用

通过结扎股动脉及分支制备裸鼠单侧后肢缺血模型，在小鼠缺血的后肢肌肉内注射CEFFE 可增加缺血组织的血流量和毛细血管密度[26]。在将脂肪颗粒移植至裸鼠，CEFFE 能降低移植裸鼠的细胞凋亡率并促进细胞增殖[30]。

4.4 CEFFE的缺陷及展望

CEFFE 是基于人脂肪提取物所获得的生物活性物质，尽管可以采集年轻、健康的捐赠者的脂肪，但捐助者的个体差异仍无法避免，需要进一步研究以获得成分稳定性更好的CEFFE。另外，目前CEFFE 的递送方式局限于原位注射，若应用于心脏领域，心肌内注射造成的损伤无法忽视，一种有效且损伤轻微的递送方式可能是后续研究的重点。