湘西桐叶药材熊果酸及齐墩果酸的HPLC法测定*

徐玉辉，周佳妮，覃爱桃，韩湘云，杨德泉

(1.湘西土家族苗族自治州食品药品检验所，湖南 吉首 416000；2.湘西宏成制药有限责任公司，湖南 吉首 416000)

桐叶为玄参科植物白花泡桐(Paulowniafortunei(Seem.)Hemsl.)的干燥叶，是土家成药复方桐叶烧伤油的原料药材.桐叶性冷、味苦，具有赶火败毒，止血消肿的功效，常被用于治疗烧烫伤、创伤出血、痈疽疔疮等.桐叶的主要成份为齐墩果酸、熊果酸、木犀草素等化合物[1-2].桐叶药材标准收载于《湖南省中药材标准(2009年版)》[3].为了解和评价湘西产桐叶药材的质量，笔者采用高效液相色谱(HPLC)法，测定了湘西产桐叶的熊果酸和齐墩果酸含量，报道如下.

1 仪器、试药和样品

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AUW220D电子天平(日本岛津公司)；KQ-3008超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司).

1.2 试药和样品

熊果酸(批号：110742-201823，99.9%)，齐墩果酸(批号：110709-201808，91.1%)，均购自中国食品药品检定研究院.乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯.

桐叶样品由本项目组人员采集于湘西土家族苗族自治州境内，采集时间为2021年7—9月，共17批(其中湘西宏成制药有限责任公司提供2批)，具体地点见表1.

表1 湘西产桐叶采样表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：TADE-PAK AF-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液(体积比61∶18∶21)；流速：1 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL.

2.2 对照品标准储备液的制备

准确称取熊果酸对照品49.81 mg、齐墩果酸对照品13.85 mg，分别置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，作为熊果酸、齐墩果酸的标准储备液，质量浓度分别为0.995 2，0.252 3 mg/mL.

2.3 供试品溶液的制备

桐叶药材粉碎研磨后过3号筛.准确称取桐叶粉末约0.4 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，超声30 min，过滤，滤液置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

2.4 系统适用性试验

按2.1色谱条件测定，记录色谱峰的理论板数，熊果酸为8 678，齐墩果酸为7 802，齐墩果酸与熊果酸分离度为1.73，均符合要求.供试品溶液两主峰的保留时间与对照品溶液相应两主峰的保留时间一致.对照品、供试品色谱图见图1、图2.

1—齐墩果酸；2—熊果酸.

1—齐墩果酸；2—熊果酸.

2.5 线性关系考察

准确吸取齐墩果酸和熊果酸对照品标准储备液0.5，1，3，4，6，10 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，配制成含熊果酸0.049 7，0.099 5，0.298 6，0.398 1，0.597 1，0.995 2 mg/mL，含齐墩果酸0.012 6，0.025 2，0.075 7，0.100 9，0.151 4，0.252 3 mg/mL的系列对照品溶液.分别精密吸取上述系列对照品溶液10 μL，按2.1节下色谱条件进样分析，以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归处理，熊果酸回归方程为Y=4 686.574 2X-6.525 9，r=0.999 9；齐墩果酸回归方程为Y=5 273.108 2X+1.175 9，r=0.999 9.结果表明，熊果酸在0.497 6～9.952 μg/mL、齐墩果酸在0.126 1～2.523 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系.

2.6 精密度试验

取T1号样品供试品溶液，连续进样6次，测得熊果酸、齐墩果酸含量测定值的RSD均为1.1%，说明仪器精密度高.

2.7 重复性试验

取T1号样品粉末6份，各0.4 g，精密称定，按照2.3节下方法制备供试品溶液，然后按照2.1节下色谱条件进行测定.熊果酸质量分数分别为6.932 5，6.924 3，7.000 2，6.952 1，6.919 3，7.047 4 mg/g，平均质量分数为6.962 6 mg/g，RSD为0.74%；齐墩果酸质量分数分别为2.927 0，2.920 1，2.976 9，2.981 8，2.904 2，2.977 1 mg/g，平均质量分数为2.947 8 mg/g，RSD为1.17%，表明HPLC法重复性良好.

2.8 耐用性试验

分别用液相色谱仪Agilent 1260Ⅱ，色谱柱Agilent C18(250 mm ×4.6 mm×5 μm，编号为588905-902，Agilent公司)和高效液相色谱仪LC-20AT，色谱柱YMC C18(250 mm×4.6 mm×5 μm，编号为HS12S05-2546WT，YMC公司)进行试验，理论塔板数按熊果酸计，均可达5 000以上.取T1号样品供试液，测定其中熊果酸和齐墩果酸含量，测得熊果酸、齐墩果酸含量测定值的RSD分别为0.64%，1.54%.结果表明，HPLC法耐用性良好.

2.9 稳定性试验

取T1号样品供试品溶液，放置0，1，2，4，8，12，24 h后，进样测定熊果酸和齐墩果酸含量，测得熊果酸、齐墩果酸含量测定值的RSD分别为1.43%，1.12%，表明HPLC法稳定性高.

2.10 加样回收率试验

取T1号样品粉末6份，每份0.4 g(水份：9.93%，按干燥品计算出样品中含熊果酸6.962 6 mg/g、齐墩果酸2.947 8 mg/g)，分别按已测得含量的80%，100%，120%，对应加入熊果酸对照品5.582 0，7.029 2，8.269 6 mg，齐墩果酸对照品2.372 2,2.965 2，3.558 2 mg，按供试液制备方法制备成为供试液，按2.1节下色谱条件测定，熊果酸、齐墩果酸加样回收率结果如表2、表3所示，T1号样品加入已测含量的80%，100%，120%熊果酸对照品后，平均回收率分别达100.15%，99.13%，100.60%；T1号样品加入已测含量的80%，100%，120%齐墩果酸对照品后，平均回收率分别达97.55%，100.73%，98.62%，表明HPLC法准确度高.

表2 熊果酸加样回收试验结果

表3 齐墩果酸加样回收试验结果

2.11 样品含量测定

准确称取桐叶粉末(过3号筛)0.4 g，置于50 mL锥形瓶中，加入25 mL甲醇，超声30 min，过滤，滤液置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，为供试品溶液.按2.1节下色谱条件进样检测，测定熊果酸、齐墩果酸的峰面积，用回归方程计算出供试品溶液中熊果酸、齐墩果酸的含量，同时测定各样品的水份.17批样品中熊果酸和齐墩果酸含量的测定结果如表4所示，结果表明湘西桐叶中熊果酸质量分数为4.543 5～7.072 5 mg/g，齐墩果酸质量分数为2.505 5～3.202 6 mg/g，不同产地桐叶中熊果酸、齐墩果酸含量略有差异.

表4 桐叶中熊果酸和齐墩果酸含量

3 讨论

李科等[4]曾采用HPLC法检测了产于湘西宏成制药有限公司基地的桐叶中所含的熊果酸、木犀草素含量，其中熊果酸质量分数为6.57 mg/g.本研究采集了湘西境内8个县(市)所产的17批桐叶药材，检测了其中熊果酸和齐墩果酸含量，结果发现，熊果酸质量分数为4.54～7.07 mg/g，平均质量分数为6.25 mg/g，接近于李科等[4]研究结果；齐墩果酸质量分数为2.50～3.20 mg/g，平均质量分数为2.82 mg/g.本研究结果显示，在7—9月，湘西不同产地的桐叶中熊果酸、齐墩果酸含量水平略有差异，可能与各产地白花泡桐生长的土壤、雨水、光照、气温等环境条件不一致有关.本研究结果可为了解和评价湘西产桐叶的质量提供参考.

本研究使用HPLC法测定桐叶药材中熊果酸和齐墩果酸的含量，研究发现此方法具备如下优点：(1)分离效果好，齐墩果酸与熊果酸分离度为1.73，与其他成分完全分离；(2)良好的线性关系，熊果酸在0.497 6～9.952 0 μg/mL、齐墩果酸在0.126 1～2.523 0 μg/mL范围内r值可达0.999 9；(3)重复性、耐用性、稳定性良好，相应测定结果的RSD均小于2%；(4)精密度、准确度高，熊果酸、齐墩果酸平均加样回收率可达97%以上.综上，HPLC法是检测桐叶主要成分熊果酸和齐墩果酸的科学有效手段.