猴头健胃灵片对功能性消化不良大鼠胃动力、脑肠肽和c-kit的影响

孙梦云 张声生 宋 瑾 王天园 郝家琪 王瑞昕

(1 北京中医药大学,北京,100029; 2 首都医科大学附属北京中医医院,北京,100010)

功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)是指餐后饱胀、早饱、上腹痛和上腹部烧灼感等症状中的一种或者多种的一组临床综合征[1]。FD是世界范围内常见的功能性胃肠病之一,全球总患病率为11.5%～14.5%[2],亚洲国家在8%～23%之间[3]。虽然FD是非器质性疾病,但其病程长、易反复,调查发现FD患者生命质量严重下降[4]。FD的发病机制目前尚未完全阐明,缺乏特效药,因此探究FD的发病机制以及寻找有效的治疗手段已经成了临床医师和科研人员亟待解决的科学问题。FD是中医的优势病种,中医认为情志失调是本病的主要病因,肝胃不和是重要病机,肝失疏泄,横逆犯胃,以致气机升降失常,治当理气解郁,和胃降逆[5]。猴头健胃灵片由猴头菌丝体、海螵蛸、醋延胡索、酒白芍、醋香附、甘草等组成,有疏肝和胃、理气止痛的功效。临床研究证实,猴头健胃灵治疗FD,在总有效率、缓解症状积分及改善生命质量等方面,均优于莫沙必利对照组[6-7],但具体机制有待进一步研究。

胃动素(Motilin,MTL)是一种能促进胃窦收缩,加速胃排空的脑肠肽,研究表明FD患者MTL分泌减少,使胃平滑肌收缩减弱或Ⅲ期收缩缺乏,进而导致胃排空延长[8]。胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)是能延缓胃排空、抑制摄食、促进胆囊收缩及诱发饱胀感等作用的脑肠肽,研究发现其与FD患者的餐后饱胀不适和早饱的症状密切相关[9]。最近的研究证实位于肌间神经丛的肠肌间卡哈尔间质细胞(Myenteric Interstitial Cells of Cajal,ICC-MY)的过度自噬和异常分化可能是导致FD胃动力障碍的机制之一[10]。中医药治疗FD的相关研究均发现,通过中药或针灸的干预,FD患者血浆中的MTL、CCK水平升高,胃肌间神经丛ICC的标志物c-kit表达上调[13-14]。以上研究提示,MTL、CCK及ICC的表达水平,既是FD发病的重要环节,又是治疗的靶点。本研究旨在在探讨猴头健胃灵片对FD大鼠胃动力的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级健康雄性SD大鼠,体质量220～250 g,每笼5只,底铺玉米芯垫料,动物的饲养完全按照实验动物的福利许可,在室温条件下,24 h灭菌饲料和饮用水供应,正常昼夜更替的光照。动物在实验开始前先适应实验环境7 d。实验动物由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供(许可证号SYXK京2018-0006)。所有实验程序符合美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)制定的准则,且经过北京中医研究所动物管理委员会批准(伦理审批号:2020060104)。

1.1.2 药物 猴头健胃灵片(主要由猴头菌丝体、海螵蛸、醋延胡索、酒白芍、醋香附、甘草等组成)(湖南新汇制药股份有限公司，国药准字Z20090592)。按照人与动物等效剂量换算系数,制作浓度为24 mg/mL的含药水溶液。实验用异氟烷(北京友诚嘉业生物科技有限公司，批号:045742)(诱导麻醉浓度2%、维持麻醉浓度1.5%)。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠MTL、CCK酶联免疫试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司,货号:CEA575Ra、CEA802Ra);c-kit多克隆抗体(Santa Cruz，美国,货号:sc-365504),石蜡切片机(Leica公司,德国,型号:RM2255)、显微镜(Carl Zeiss公司,德国,型号:Axio Scope A1)、石蜡包埋机(Leica公司,德国,型号:EG1150C)、摊片机(Leica公司,德国,型号:HI1210)、高通量组织研磨仪(深圳信仪测控技术有限公司,型号:Scientz-48)、多功能酶标仪(BioTek公司,美国,型号:Synergy H1)、电子恒压器及Protocol Plus Deluxe数据处理分析系统(G&J Electronics公司,加拿大，型号：9.6R)、Powerlab放大器(ADI公司,澳大利亚,型号:ML 0146/25-220)、四通道高效记录仪(ADI公司,澳大利亚,型号:PL 3508-0028)、张力换能器(ADI公司,澳大利亚,型号:MLT 02021D)、数据处理分析系统(ADI公司,澳大利亚,型号:PowerLab/4SP)、超级恒温槽(上海越平科学仪器有限公司,型号:CH-1015)、电子分析天平(上海菁海仪器有限公司,型号:Y211407011)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 30只大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、猴头健胃灵组,每组10只。参照文献[15]的方法对模型组和猴头健胃灵组采用夹尾刺激法进行FD造模。每5只大鼠同笼,用长海绵钳夹大鼠尾巴远端1/3处,以不破皮为度,令其暴怒,与其他大鼠撕打,进而激怒全笼大鼠。每次连续不断地刺激30 min,随着打斗的加剧,大鼠可能被抓伤,为避免炎症干扰,用0.15%聚维酮碘涂擦受伤部位控制感染。4 h刺激1次,3次/d,实验周期安排避免干扰大鼠的生物节律。

1.2.2 给药方法 连续刺激7 d后,猴头健胃灵组予以猴头健胃灵片含药水溶液(24 mg/mL)1 mL/100 g灌胃治疗;空白组与模型组以等体积的纯水灌胃,1次/d,持续灌胃7 d。灌胃期间仍予以夹尾刺激。

1.2.3 检测指标与方法 1)胃排空率检测:实验前将空白组、模型组和猴头健胃灵组分别分装,每只鼠笼1只大鼠,禁食24 h。每只动物分别自由进食标准维持鼠粮,1 h后撤食。2 h后,过量麻醉处死动物,沿腹中线剖开腹腔,结扎胃幽门和贲门,取出胃。将胃内容物取出并烘干称重,计算胃内残留物占所进食的重量百分比为胃内残留率。胃排空(Gastric Emptying,GE)率的计算公式为:GE(%)=(1-胃内残留食物重量/摄取食物重量)×100%。胃排空率测定后剩余的胃组织放入4%多聚甲醛中固定用于免疫组织化学实验。2)离体胃平滑肌条张力检测:灌胃结束后,按照本课题组以前发表的论文中描述的方法,采用器官灌流装置和张力换能系统对各组大鼠进行离体胃肌条动力测定[16]。将大鼠预先禁食24 h,自由饮水。使用2%异氟烷诱导麻醉后,将其水平置于大鼠固定板上,通过面罩持续给予1.5%异氟烷维持麻醉,腹主动脉采血、收集血浆后备用酶联免疫吸附试验法检测MTL和CCK浓度。切开腹部,快速取出胃体,用K-H(Krebs-Henseleit)缓冲液冲洗胃内容物,沿着胃大弯处剪开,黏膜层朝上平铺于硅胶上,在体视镜下用显微剪小心剪去黏膜及黏膜下层,整个操作过程均在冰上完成。将平滑肌层沿纵行肌剪成1～2 mm宽,9～11 mm长的肌条,用外科缝线在肌条的两端结扎,一端固定在浴槽的底部,另一端悬挂于压力换能器。肌条置于盛有恒温(37±0.5)℃、持续通气(95%O2与5%CO2)5 mL的K-H缓冲液里内。给肌条施加1 mN的静息张力后,使其在水浴中平衡30 min左右,待基线稳定后开始观察记录其收缩曲线。肌条动力指数根据按收缩曲线下与时间的积分求得。3)酶联免疫吸附试验法检测血浆MTL、CCK含量:使用武汉云克隆科技股份有限公司生产的MTL、CCK酶联免疫试剂盒和美国BioTek公司生产的Synergy H1多功能酶标仪(H1M),按照说明书的步骤进行血浆中MTL和CCK含量的检测。4)免疫组织化学法检测胃组织c-kit表达:将固定好的胃组织脱水、石蜡包埋,切成厚度4 μm的薄片,放入45 ℃恒温箱中烘干,用二甲苯溶液脱去组织切片中的石蜡,后依次浸泡入高浓度到低浓度的乙醇中,最后放入蒸馏中浸泡。将切片放入柠檬酸钠溶液中,98～100 ℃抗原修复,10 min后自然冷却,后放入磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)冲洗3次,3 min/次。每个组织加1滴3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,避光10 min后放入PBS冲洗3次。每个组织滴5%BSA1～2滴,封闭20 min。小鼠源c-kit多克隆抗体稀释液(1∶100)4 ℃孵育过夜,PBS冲洗3次后,每个组织滴辣根过氧化物酶标抗鼠聚合物1滴,室温孵育20 min,PBS冲洗3次。新鲜配制的DAB工作液染色7 min后,流水冲洗后经苏木精复染、各级乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后使用显微镜拍照记录。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、进食量及胃排空率 在造模过程中,空白组大鼠精神良好,活动灵敏;模型组大鼠随着造模进程逐渐出现进食量减少、毛发枯萎。模型组大鼠24 h固体食物摄入量与空白组大鼠比较显著减少(P<0.05)、体质量显著减轻(P<0.001);猴头健胃灵组大鼠在服用药物后,精神状态逐渐恢复,固体食物摄入量增多(P<0.05)、体质量显著增加(P<0.001)。模型组大鼠固体食物胃排空率与空白组比较有降低趋势,猴头健胃灵治疗的大鼠胃排空率显著高于空白组和模型组大鼠。见表1。

2.2 胃平滑肌动力 模型组大鼠胃离体平滑肌的收缩幅度与空白组比较显著下降,动力指数显著低于空白组(P<0.05);猴头健胃灵可以促进大鼠胃离体平滑肌的收缩幅度,显著提高动力指数(P<0.01)。见图1,表1。

表1 各组大鼠体质量、进食量及胃动力指标

2.3 血浆MTL和CCK水平 与空白组比较,模型组大鼠血浆MTL、CCK的含量显著下降(P<0.05);而猴头健胃灵组大鼠血浆中MTL和CCK的水平与FD比较显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清MTL和CCK的水平

2.4 胃c-kit免疫阳性的表达 ICC的标志物c-kit分布在胃平滑肌全层均有分布,其中环形肌和纵行肌的肌束中分布较少,而肌间神经丛则分布较多;与空白组和模型组比较,猴头健胃灵观察组大鼠胃肌间神经丛中c-kit免疫阳性细胞显著增多。见图2。

3 讨论

MTL是近端小肠M细胞分泌的一种脑肠肽,能促进胃窦收缩、加速胃排空,调控摄食与情绪,具有饥饿信号的功能[17]。众所周知,MTL的水平是随着消化间期胃移行性复合运动(Migrating Motor Complex,MMC)的周期波动的,在Ⅲ相收缩期是最高[17]。临床研究发现,在FD胃排空延迟的患者中,血浆MTL水平在消化间期和Ⅲ相收缩期出现异常波动[18]。一种新型的小分子MTL受体激动剂,可以在饥饿状态下诱导胃Ⅲ相收缩期收缩,并剂量依赖性地促进胃排空[19],该药目前处于二期临床试验阶段。Liang等[20]通过饥饿、悬尾、激怒和强迫游泳的方法制作FD大鼠模型,当模型大鼠出现胃肠动力障碍时,其血浆中的MTL和CCK水平显著低于空白组。一项针刺治疗FD的随机对照临床试验发现,针刺足三里、梁门、太冲等穴位不但可以显著降低FD患者的症状积分,还可以显著升高患者血浆的MTL含量[21]。另一项采用束缚应激所致FD大鼠模型的研究发现,苍术精油可以显著促进FD大鼠的胃排空,并升高血浆MTL的水平[22]。本研究发现夹尾刺激所致的FD大鼠模型出现体质量下降、胃排空延迟及离体胃动力减弱,血浆MTL及CCK水平均下降,经猴头健胃灵治疗后,体质量上升、胃排空率增加、离体胃动力增强,同时血浆MTL及CCK水平升高。本研究与临床及基础研究结果基本一致,但由于MTL的水平会随着胃MMC的周期产生波动,而本研究中血浆MTL的水平并未根据MMC的分期进行测定,因此具有一定的局限性。

CCK是一种小肠上段Ⅰ型细胞释放的脑肠肽,在食物摄入后尤其是在含有高脂肪或蛋白质的餐后大量释放[23]。在幽门螺杆菌感染相关的FD患者中,与幽门螺杆菌阴性患者比较,CCK的基础值显著降低[24]。对健康志愿者输入CCK可以增强胃的顺应性,但遗憾的是这项研究并未在FD患者的身上得到证实[25],目前CCK受体激动剂用于治疗FD尚未进入临床试验。本研究发现，猴头健胃灵治疗FD模型大鼠1周后,观察组大鼠血清中CCK含量显著高于模型组。这可能是猴头健胃灵促进FD大鼠胃动力的机制之一。

已经证明,ICC是胃肠道的起搏器细胞,起搏细胞电位通过ICC或ICC和平滑肌肉之间的间隙结传递给附近的细胞。因此,ICC对胃肠动力的影响至关重要,其结构及功能的异常又与多种胃肠动力障碍疾病密切相关[26]。Hayashi等[27]研究发现,高血糖可以通过c-kit的表达增加,从而导致胃排空加快,该研究提示我们,ICC表达的上调可能是导致部分患者胃排空加快的原因。而Zhang等[10]发现FD大鼠模型的ICC-MY中细胞自噬的标志物Beclin1和LC3B表达上调,而细胞分化的标志物c-kit和干细胞因子的下调,提示FD大鼠的胃排空延迟可能与ICC-MY的过度自噬和异常分化导致的胃动力障碍有关。本研究发现,FD模型大鼠ICC分化的标志物c-kit的表达水平与空白组比较无明显变化,然而猴头健胃组大鼠胃c-kit表达水平显著上调,提示我们猴头健胃灵片可能通过调控ICC的分化,进而发挥促进胃动力的作用。