余甘子果渣抑菌免洗凝胶的制备工艺研究

谭庆刍 黄浩洲 罗传红 李 莞 莫太刚 张定堃 韩 丽 林俊芝

(1 成都中医药大学药学院,西南特色中药资源省部共建国家重点实验室,成都,611137; 2 成都市三勒浆药业集团四川华美制药有限公司,成都,610045; 3 成都中医药大学附属医院,代谢性疾病中医药调控四川省重点实验室,成都,610072)

余甘子为大戟科植物余甘子PhyllanthusemblicaL.的干燥成熟果实,是我国西南地区的重要经济作物[1]。余甘子风味独特、营养丰富,由于其保健功效突出,被联合国作为保健植物进行推广种植[2-3]。目前,全世界大约有17个国家及地区在自己的传统药物体系中使用了余甘子,在印度阿育吠陀(Ayurveda)医学中具有很高的地位,在中国蒙古族、藏族、彝族、维吾尔族等多个民族医学体系中高频使用[4]。该品种1977年被载入《中华人民共和国药典》,并列入原卫生部“药食同源”名单,现今成为西南地区乡村振兴的重点支撑品种。

课题组在四川、云南等地实地调研发现,余甘子生产主要以鲜果榨汁为主,其生产过程中会产生2种主要固废物,一是余甘子榨汁后产生大量果渣,干燥重量约为鲜果的30%,单个药企年产可达300吨[5],主要通过晒干后填埋处理;另一种是其鲜汁静置过程产生的大量沉淀物,年产近百吨,主要通过生物氧化处理,环保压力大。由于鲜果压榨对多酚的提取并不充分,果渣中含有大量的酚类物质,具有较强的酸性与腐蚀作用,掩埋后还可能影响土壤性质。本研究首先比较研究了余甘子果渣与余甘子药材的化学成分及含量差异,筛选了主要抑菌活性成分,以此指导余甘子果渣的最优提取工艺,并采用Box-Behnken响应面法优选余甘子果渣抑菌免洗凝胶的制剂处方,以期探索余甘子果渣的综合开发途径。

1 仪器与试药

1.1 仪器 液相色谱仪(岛津公司，日本，型号:LC-2010AHLT),Milli-Q超纯水仪(Millipore公司，美国，型号:Reference),振荡培养箱(上海知楚科技有限公司，型号:ZQLY-180V),生物安全柜(青岛海尔生物医疗有限股份公司，型号:HR30-ⅡA2),低温冰箱(合肥美菱股份有限公司，型号:BD-169C),1/10 000分析天平德国Sartorius公司，型号:BSA224S)1/100 000分析天平(Sartorius公司，德国,型号:BT25S),RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号:RE-52),冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司，型号:SCIENTZ-10N),质构仪(上海腾拔仪器科技有限公司，型号:Rapid TA+),pH计(济南好来宝医疗器械有限公司，型号:PHS-3C)。

1.2 试剂 没食子酸(成都克洛玛生物科技有限公司，批号：CHB201131,纯度≥98%),诃黎勒酸、柯里拉京、鞣花酸(成都普瑞法科技开发有限公司，批号：whq21050704、whq21040907、whq21010403;纯度均≥98%)。脑心浸出液肉汤培养基(商城北纳创联生物科技有限公司，货号：20210601),琼脂粉(成都科隆化学品有限公司，批号：2019081301),大肠杆菌(Escherichiacoli),批号：BNCC336902、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，批号：BNCC337946、白念珠菌(candidaAlbicans),批号：BNCC352028购于商城北纳创联生物科技有限公司;庆大霉素(0.04 g/mL西南药业股份有限公司，批号：230141504),其余试剂为分析级。

1.3 分析样品 余甘子果渣样品S1-S10,对应余甘子药材样品S11-S20(来源于成都三勒浆药业在云南产地进行鲜果榨汁产生的果渣,以及课题组在云南楚雄等产地收集),经成都中医药大学药学院许润春副教授鉴定为大戟科植物余甘子Phyllanthusemblica的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 余甘子果渣与余甘子药材的化学成分比较

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.2%磷酸水溶液-甲醇,采用梯度洗脱,洗脱程序:0～6 min,5%甲醇;6～15 min,5%～7%甲醇;15～20 min,7%～15%甲醇;20～25 min,15%～21%甲醇;25～31 min,21%～22%甲醇;31～41 min,22%甲醇;41～47 min,22%～28%甲醇;47～51 min,28%～32%甲醇;51～57 min,32%～38%甲醇;57～70 min,38%～45%甲醇;70～80 min,45%～65%甲醇;检测波长为270 nm;体积流量为1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样量10 μL[6]。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取没食子酸、柯里拉京、诃黎勒酸,鞣花酸对照品适量,精密称定,分别置于容量瓶中,加50%甲醇配制质量浓度分别为0.129 mg/mL、0.072 mg/mL、0.103 mg/mL、0.180 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取余甘子果渣粉末或药材粉末(过3号筛,下同)0.1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,称定质量,超声20 min(300 W,40 kHz),放冷,加50%甲醇补足减失的质量,摇匀,过0.22 μm微孔滤膜,即得。

2.1.4 样品含量测定 取10批余甘子果渣样品与10批余甘子药材样品,按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件进行测定,计算样品中没食子酸、柯里拉京、诃黎勒酸与鞣花酸的含量。

2.2 余甘子果渣中主要抑菌活性成分筛选

2.2.1 菌悬液的制备 取适量白念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种于肉汤培养基,白念珠菌于28 ℃培养48 h,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌于37 ℃培养24 h后采用麦氏管比浊法配成106CFU/mL的菌液,备用[7]。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取没食子酸、柯里拉京、诃子勒酸、鞣花酸适量,用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)定容于容量瓶中,配制成浓度分别为0.131 mg/mL、0.110 mg/mL、0.177 mg/mL、0.131 mg/mL的供试品溶液,阳性组为10 μg/mL庆大霉素。

2.2.3 活性成分最低抑菌浓度测定 取无菌96孔板,每孔加入100 μL含有0.5%2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC)无菌培养基,每组样品设定3个平行对照,取100 μL供试品溶液加入每排第1孔,与培养基充分混合,从中取100 μL加入到第2孔中,混合均匀后再取100 μL到第3孔中,以此类推,直到第11孔,取出100 μL弃去,阳性对照为庆大霉素,阴性对照为空白DMSO培养基,在恒温培养箱中放置24 h,根据微孔中是否具有出现红色来判断有无细菌生长,最低抑菌的浓度的判断标准为微孔中不出现TTC红色,各项操作均在无菌环境下进行[8]。

2.3 余甘子果渣提取工艺的优化

2.3.1 提取次数考察 精密称取适量同一批次余甘子果渣各5份,分别加入70%乙醇,固定其料液比为1∶10,回流2 h,分别提取1、2、3次,提取液经过过滤、浓缩、定容得到供试品溶液,以筛选出的主要抑菌成分含量为指标进行筛选。

2.3.2 提取时间考察 精密称取适量同一批次余甘子果渣各5份,分别加入70%乙醇,固定其料液比为1∶10,提取次数为1次,分别回流0.5、1、2、3、4 h,提取液经过过滤、浓缩、定容得到供试品,以筛选出的主要抑菌成分含量为指标进行筛选。

2.3.3 乙醇浓度考察 精密称取适量同一批次余甘子果渣各5份,分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇,固定料液比为1∶10,回流2 h,提取次数为1次,提取液经过过滤、浓缩、定容得到供试品,以筛选出的主要抑菌成分含量为指标进行筛选。

2.3.4 料液比考察 精密称取适量同一批次余甘子果渣各5份,分别加入70%乙醇,使其料液比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12,回流2 h,提取液经过过滤、浓缩、定容、干燥,得到供试品,以筛选出的主要抑菌成分含量为指标进行筛选。

2.4 余甘子果渣抑菌免洗凝胶的制备工艺优选

2.4.1 余甘子果渣提取液的制备 按照“2.3”中筛选出的最优提取工艺制备果渣提取液。

2.4.2 基质的筛选 凝胶剂属局部外用制剂,根据凝胶剂的特点,处方中除主药外,应包含凝胶基质、保湿剂、防腐剂等。参考凝胶剂的常用基质,用于制备凝胶的辅料以卡波姆U20、卡波姆U21、卡波姆940、甲基纤维素(Methyl，MC)、羧甲基纤维素钠(Carboxymethyl Cellulose-Na,CMC-Na)等较为常用,这些凝胶材料也是常用的生物黏附材料,在体内均能生物降解,对皮肤刺激性小,制备免洗凝胶剂的关键是基质筛选,通过感官评价评分对基质进行筛选。

2.4.3 不同基质凝胶制备工艺筛选 称取去离子水20 g于500 mL烧杯中,分别称取卡波姆U20 0.4 g[9]、卡波姆U21 0.4 g[10]或卡波姆940 0.4 g[11]分散至水中待其完全溶胀,或缓慢加入MC 3 g[12]或CMC-Na 4 g[13]继续搅拌制成凝胶,加入30 g药液、3 g甘油、95%乙醇10 g,用TEA调pH值为5～6,搅拌均匀,纯化水补重到100 g,比较5种基质的成型效果,筛选最优成型基质。

2.4.4 响应面优化余甘子果渣抑菌免洗凝胶处方 以各配方样品的感官指标(包括透明度、涂展性、残留量、肤感)及理化指标(包括黏度、黏着性、稠度、稳定性)为评价指标,针对余甘子果渣免洗凝胶成型的主要成分果渣提取液、卡波姆U20、甘油,采取响应面设计的方法优化处方比例。配方样品的感官指标评分标准见表1,用量范围见表2，响应面设计结果见表3。配方样品的理化指标采用质构仪测定,采用A/BE-d45探头,将触发力设置为3 g,将探头的前进速度设置为0.3 mm/s,接触保持时间为10 s,在测定完成后探头回收速度1 mm/s,将测定距离设置为10 mm,分别对不同条件下制备的余甘子果渣抑菌免洗凝胶进行质构分析,对质构分析曲线进行积分处理,黏着性(Firmness)用最小力表示,稠度由正峰面积表示;黏度指标(Index of Viscosity)以负峰面积表示,分值范围为1～10分[14]。

表1 感官评价考察指标赋分值

表2 凝胶剂处方范围

表3 Box-Behnken设计因素及水平

2.4.5 抑菌效果验证 在无菌环境下进行操作,将106CFU/mL的菌悬液0.2 mL涂布在凝固的平板表面,平行3份;将5 mm滤纸片分别放置于凝胶及无菌水液体中,浸泡4 h,在生物安全柜中用无菌镊子进行操作顺时针将滤纸片均匀安置于培养平板中,37 ℃培养24 h,等待培养时间结束后准确测量抑菌圈直径,计算平均值[15]。

2.4.6 工艺验证 按响应面优化得出最终处方同时进行3批实验验证,计算最终评分。

2.5 结果

2.5.1 含量测定结果 余甘子果渣样品与余甘子药材样品的高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)图谱见图1,含量测定结果见表4。由图谱结果可以看出,余甘子果渣与余甘子药材的成分基本相同,但测定的4个成分含量不同,相对较低。没食子酸在余甘子果渣中含量为0.218%～2.148%,在余甘子药材中含量为0.991%～3.176%;柯里拉京在余甘子果渣中含量为0.004%～0.039%,在余甘子药材中含量为0.760%～0.813%;诃黎勒酸在余甘子果渣中含量为0.063%～0.202%,在余甘子药材中含量为0.716%～2.735%;鞣花酸在余甘子果渣中含量为0.040%～0.105%,在余甘子药材中含量为0.394%～0.652%。余甘子鲜果在压榨过程中,多酚类成分并未被完全提取出,部分批次果渣中残留量较高,具有进一步开发的价值。

表4 余甘子果渣与余甘子药材中4种活性成分的含量(%)

2.5.2 指标成分的抑菌活性筛选 诃黎勒酸、柯里拉京、没食子酸与鞣花酸对白念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果见表5。由结果可知,4种指标成分对3种细菌菌株均具有一定的抑制作用,阴性组每孔均有细菌生长,说明空白溶剂对细菌生长无抑制作用。诃黎勒酸、柯里拉京、没食子酸对3种菌种的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)均低于10 μg/mL,其中诃黎勒酸的抑菌效果最强,而鞣花酸的MIC为16.38～32.75 μg/mL,明显弱于其他3种,故后续提取工艺优化选择没食子酸、诃黎勒酸与柯里拉京含量作为评价指标。

表5 4种活性成分MIC(μg/mL)

2.5.3 提取工艺的考察结果 提取次数筛选结果如图2A,由结果可知,随着提取次数的增加,有效成分提取总量变化不明显,这可能是果渣中的有效成分在第一次提取时就基本上被提取完成,从控制成本的角度考虑,提取次数定为1次。提取时间的筛选结果如图2B,随着提取时间的延长,提取总量逐渐增多,在2 h时出现峰值,之后继续延长提取时间,提取总量反而减少,这与诃黎勒酸、柯里拉京长时间受热后的降解有关,没食子酸的不断增加也是诃黎勒酸不断水解的结果[5]。故确定最优提取时间为2 h。乙醇浓度筛选结果如图2C,随着乙醇浓度的升高,3种成分的提取率均出现增高,但是在乙醇浓度达到70%后,总含量随着醇浓度的增加而呈现下降趋势,故确定70%的醇浓度为最优提取浓度。料液比筛选结果如图2D,料液比对提取量有重要影响,在料液比为1∶4、1∶6时提取物含量较低,在达到1∶10后,提取总量变化不大,总体呈现料液比越高,提取物总量越高的趋势,故确定最优料液比为1∶10。综上所述，优选出的提取工艺为“取余甘子果渣,加入10倍体积的70%乙醇,回流2 h,提取1次,提取液经滤过、定容得到供试品”。

2.5.4 基质的选择结果 凝胶剂的基质考察结果见表6。由结果可知,当选择MC或CMC-Na作为凝胶基质时,加入药液后凝胶体系易发生絮凝而浑浊,且使用时较为油腻,涂展性差,在手背残留量较大,稳定性不好。而选择卡波姆系列作为凝胶基质时,整体感官明显优于MC或CMC-Na,肤感清爽且保湿持久。实验中发现,以卡波姆U20为基质时,制备出的凝胶颜色金黄且透明度良好,使用清爽不油腻,相对最优,故采用卡波姆U20作为余甘子果渣抑菌免洗凝胶的基质。

表6 不同基质考察结果

表7 Box-Behnken响应面设计实验安排及结果

2.5.5 Box-Behnken优化处方结果 基质处方的Box-Behnken响应面设计实验安排及结果见表7。由结果可知,随着卡波姆、甘油、药液比例的变化,凝胶性质的综合得分明显不同,在54.56～76.54之间波动。利用软件Design-Expert 12.0分析对表中的数据进行多元回归拟合分析,得到基质综合评分与各因素变量的二次方程模型为Y=74.94+2.15×A+0.616 7×B-3.75×C-0.222 5×AB-1.22×AC-0.260 81×BC-4.50×A2-2.19×B2-10.53×C2,回归方程模型方差分析结果如表8,不同卡波姆、药液、甘油用量对综合评分交互影响的等高线及响应面如图3所示,此模型具有显著性(F=41.40,P=0.000 4<0.05)。失拟项不显著(P=0.611 2>0.05),说明该二次方程能够较好地拟合真实水平,实验失误小,可用此模型对余甘子果渣免洗凝胶基质进行预测。模型一次项A、C显著,B不显著,交互项BC显著,AC、AB不显著,二次项A2、C2显著B2不显著,根据F值可知各基质用量对余甘子果渣免洗凝胶处方量的综合评分影响程度为C>A>B,即果渣提取液用量>卡波姆用量>甘油用量。

表8 回归模型方差分析结果

各项指标综合结果评分曲面得出的最佳处方组成为:30%果渣提取液、0.4%卡波姆、3%甘油、4%的95%乙醇、三乙醇胺调pH值到5～6,其为纯化水,余甘子免洗凝胶综合评分为74.93。同时进行3批验证实验,平均值73.88,相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值为0.39%,表明该优化制剂处方稳定可靠。

2.5.6 抑菌效果验证 使用优化工艺制备的余甘子果渣抑菌免洗凝胶,验证对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、大肠杆菌的抑菌效果。结果发现,余甘子果渣抑菌免洗凝胶对金黄色葡萄球菌、白念珠菌、大肠杆菌的抑菌圈直径分别为1.12 cm、1.15 cm、1.00 cm;阳性组为庆大霉素,对3种细菌的抑菌圈直径分别为1.30 cm、1.42 cm、1.40 cm。上述结果表明,余甘子果渣抑菌免洗凝胶具有较好的抑菌效果。

3 讨论

本研究通过化学成分比较,证明了余甘子鲜果榨汁后得到的果渣具有与余甘子药材相同的组成、可提取的多酚及其开发利用的价值。通过对4种指标成分的抑菌活性比较,发现没食子酸、柯里拉京、诃黎勒酸具有较好的抑菌活性。有研究表明,没食子酸能改变金黄色葡萄球菌细胞膜的渗透性完整性,明显抑制金黄色葡萄球菌胞可溶性蛋白的表达[16],而诃黎勒酸是一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂,对鲍曼不动杆菌的生长活动具有明显抑制作用[17]。在体外培养基中发现,将柯里拉京加入到培养基中可减少青霉素结合蛋白(Penicillin-binding Protein2a，PBP2a)的产量[18],同时柯里拉京在一定程度上抑制了β-内酰胺酶活性,可显著性增强β-内酰胺类抗生素如苯唑西林、头孢美唑的抗耐甲氧西林金葡菌作用。由于在回流过程中,诃黎勒酸首先产生1分子柯里拉京和1分子的诃子次酸,柯里拉京则继续水解生成没食子酸[19-20],推测这2种成分的抑菌机制与没食子酸相似,也是通过破坏细菌细胞膜的完整性以及抑制菌体蛋白质产生,或者改变细胞膜的通透性引起胞质外渗等方式表达抑菌作用。

进一步通过优化提取工艺及凝胶剂基质配方,得到了余甘子果渣抑菌免洗凝胶。见图4。该品呈金黄色,质地细腻,有均匀光泽,表面无气泡,涂在手背上可均匀涂开,涂展性好。其pH值为5.87～5.98,与人体皮肤pH值相似,符合抑菌凝胶要求。离心30 min后凝胶性状无明显变化,证明具有较好的稳定性。依据《2019版消毒产品卫生安全评价技术要求》,对产品的质量相关项进行研究,初步建立余甘子果渣免洗凝胶质量标准,为后期余甘子果渣抑菌免洗凝胶的产品开发上市提供研究基础。