蛇床子挥发油指标成分含量测定的研究

张 迪 曹远东 钟 慧 卢 兴 黄 玲 王艳宁▲

1.南宁市第一人民医院药学部，广西 南宁 530022；2.四川九渊医药科技有限公司，四川 绵阳 621000

蛇床子为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实，性温、味苦，有小毒，具有燥湿祛风、杀虫止痒、温肾壮阳的功效，可用于治疗阴痒带下、湿疹瘙痒、湿痹腰痛、肾虚阳痿和宫冷不孕[1]。在临床上，多外用于治疗各种皮肤病及滴虫性阴道炎，手、足癣感染等疾病[2]，有抗癌、抗滴虫、雌激素样等药理作用[3]。

关于蛇床子内的活性物质，国内外已经有了大量的研究，其主要成分有香豆素类、挥发油、色原酮及萜类等[4-8]。宋更申等[9]使用气相色谱-质谱（GC-MS）法实现了同时测定蛇床子中7 种香豆素类活性成分；宋丽娇等[10]建立了一种可以同时测定蛇床子中6 种香豆素成分的高效液相色谱（HPLC）法；早在1920 年前，日本人中尾万三首先从中国东北产的蛇床子挥发油中分离出来左旋蒎烯与左旋莰烯；孟正木等[11]应用气相色谱-质谱-计算联用技术从蛇床子挥发油中分离出66 个化学成分。对蛇床子挥发油中所含有的主要成分的研究及检测分析方法已经较为全面[12-14]，但对挥发油中具体成分的含量测定还未见报道。2015 年版《中华人民共和国药典》[1]一部收载的中药蛇床子，依然采用传统的性状和显微鉴别来确定真伪，含量测定也仅以测定蛇床子素这一种成分来控制质量，具有片面性，质量标准有待完善和提高[15]。本研究提取了不同产地的5 种蛇床子中药材中挥发油，经GC-MS 分析后选出莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯作为共有指标成分，建立一种同时测定3 种指标成分具体含量的气相色谱（GC）法，为进一步完善中药蛇床子质量控制标准提供依据。

1 仪器与材料

GC2MS/QP2010 气 相 色 谱- 质 谱 仪（日 本 岛津公司）；GC9720 气相色谱仪（中国福立仪器有限公司） ；BT25S 电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；HS3120 超声清洗仪，（北京恒奥德科技有限公司）。

5 种中药材蛇床子购自广西、安徽、河北正定、浙江、河北安国,经鉴定为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实；莰烯对照品，纯度＞99%，批号L1614003，上海阿拉丁试剂有限公司；β-蒎烯对照品，纯度＞99%，批号A1720070，上海阿拉丁试剂有限公司；乙酸龙脑酯对照品，纯度＞98%，批号20161114，宝鸡晨光生物科技有限公司；无水甲醇（分析级），江苏强盛能化学股份有限公司；无水硫酸钠（分析级），天津市永大化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 挥发油的提取[16]

分别称取不同产地干燥的蛇床子中药材各200 g 于2 L 圆底蒸馏烧瓶中，加入纯化水1200 ml，安装挥发油提取器装置，用常规水蒸气蒸馏法加热蒸馏，蒸馏至待蒸出的挥发油成分不再增加时，停止加热。流出液分别以无水硫酸钠脱水，得到淡黄色透明的挥发油液体，结果见表1。

表1 不同产地蛇床子挥发油提取结果

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC-MS 条件[17]柱温：程序升温，起始温度50 ℃，以3 ℃/min 的速率升温至120 ℃，以5 ℃/min 的速率升温至200 ℃；分流比：10 ∶1；进样口温度：260 ℃；柱流量：1.5 ml/min；进样隔垫吹扫流量；离子源：EI；检测口温度：260 ℃；采集延时：3 min；色谱柱为：DB-5。

2.2.2 GC-MS 分析 分别用移液枪吸取5 种蛇床子挥发油50 μl，用无水甲醇稀释100 倍后，进样0.2 μl。结果共有19 种含量大于1% 不同成分析出挥发油成分均列出，不同产地的5 种蛇床子挥发油所含成分不尽相同，河北产蛇床子挥发油所含成分种类最多，经比较选出79-92-5 莰 烯，18172-67-3 β- 蒎 烯，76-49-3乙酸龙脑酯等共有成分进行含量测定。见图1、表2。

表2 蛇床子挥发油GC-MS分析结果

图1 广西（A）、安徽（B）、河北正定（C）、浙江（D）和河北安国（E）产蛇床子挥发油GC-MS 图

2.3 含量测定

2.3.1 混合对照品储备液的配制 精密称定一定质量的莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯对照品，置于10 ml容量瓶中，用无水甲醇溶解、稀释、定容，制成混合对照品储备液，其中莰烯的浓度为1.342 mg/ml、β-蒎烯的浓度为0.273 mg/ml、乙酸龙脑酯的浓度为1.488 mg/ml，备用。

2.3.2 供试品溶液的配制 精密称量不同产地的5 种蛇床子中提取的挥发油约52 mg，置于5 ml 容量瓶中，用无水甲醇溶解、稀释、定容后，再精密量取定容好的蛇床子挥发油溶液2 ml 于5 ml 容量瓶中，用甲醇稀释到相应刻度作为供试品溶液。

2.3.3 气相色谱条件 DB-5 毛细管柱，FID 检测器，载气为N2（99.999%），N2流速30 ml/min，H2流速30 ml/min，空气300 ml/min，进样量1.0 μl，分流比10 ∶1，柱温为程序升温，起始温度50℃，以3℃/min 的速率升温至80℃，以10℃/min 的速率升温至200℃；进样口温度260℃，检测口温度260℃。

2.3.4 方法学考察 专属性实验：分别吸取供试品溶液、对照品溶液与溶剂各1.0 μl，进样，记录色谱图。实验结果见图2，表明甲醇色谱图中在与样品对照品相应保留时间处未出色谱峰，空白溶液对样品测定无干扰，方法的专属性良好。

图2 甲醇溶剂（A）、混合对照品溶液（B）和挥发油供试品溶液（C）的气相色谱图

线性关系考察：分别量取制备的混合对照品溶液2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 ml，置于2 ml 容量瓶中，用甲醇溶液溶解、稀释、定容，即得一系列浓度的混合对照品溶液，分别吸取1.0 μl 进样，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归得出线性方程与回归系数并算出线性范围。线性关系考察结果见表3。

表3 线性关系考察结果

精密度实验：吸取莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯混合对照品溶液1.0 μl，连续进样6 次，测定三种指标成分的峰面积，计算RSD 值。莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯对照品混合经GC 测定后，精密度结果见表4，结果表明，仪器精密度较好。

重复性实验：取适宜浓度的蛇床子挥发油样品溶液6 份，按2.3.2 项的方法制备供试品溶液，吸取1.0 μl 进样，测定峰面积，计算各成分浓度的平均值和RSD 值。重复性试验结果见表4，莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯的RSD 值分别为：2.41%、2.45%、3.73%，表明方法的重复性良好。

稳定性实验：精密量取同一蛇床子挥发油样品溶液，分别于0、2、4、6、 8、10、24 h，吸取1.0 μl 进样，测定三种指标成分的峰面积，计算RSD 值。稳定性试验结果见表4，表明供试品溶液中三种指标成分在24 h 内稳定。

表4 蛇床子挥发油中三种指标成分的精密度、重复性和稳定性实验结果

加样回收率实验：吸取已知三种指标成分含量的蛇床子供试品溶液1.0 ml 6 份置于2 ml 容量瓶中，分别准确加入已知浓度的莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯混合对照品溶液1.0 ml，同样方法制备成供试品溶液，精密吸取1.0 μl 进样，测定峰面积，计算加样回收率，平均回收率和RSD 值。加样回收测定结果见表5。

表5 加样回收测定结果（n=6）

样品含量的测定：分别取5 种蛇床子挥发油约52.0 mg，精密称定，按2.3.2 项的方法制备供试品溶液，吸取1.0 μl 进样，进行气相色谱分析，测定三种指标成分的峰面积，用外标法测定莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯的含量（表6）。不同产地的蛇床子挥发油中含量有所不同：浙江产的蛇床子的含油率很高，但是指标物质的含量较低。河北产的2 种蛇床子得油率最低，但是指标物质的含量最高，其中河北安国的莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯的含量最高，故初步认定河北产的蛇床子药材质量较好，但同一省份不同产地蛇床子质量也存在一定差异。

表6 5种蛇床子挥发油中三种指标物质的含量测定结果（mg/g）

3 结论

蛇床子在真菌感染及肿瘤细胞抑制方面的有良好的功效，经常用于各种湿疹等皮肤疾病，在各级医院中使用量较大，具有较好的应用前景[18-19]，因此对蛇床子药材的质量控制显得尤为重要，其中挥发油的质量可作为蛇床子中药材质量的评价指标之一[20]。本研究建立了同时测定蛇床子挥发油中莰烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯三种活性成分含量的GC法。结果表明，建立的分析方法简便、快速，增加了蛇床子临床疗效的质量控制指标，为完善现有国家标准的提供依据。