CRISPR/Cas9 基因编辑技术在肿瘤研究治疗中的应用

周岚，于鸿浩

（桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541199）

0 引言

恶性肿瘤是一种高死亡率疾病，在全球范围内发病率逐年上升，严重威胁着类的生存[1]。尽管在恶性肿瘤治疗领域取得了一系列令人振奋的成就包括手术治疗、靶向生物治疗、放疗、化疗、和新的联合治疗等，但术后高复发率、药物毒副作用、放/化疗耐药性仍严重影响着患者生存时间和生活质量[2]。研究表明，所有恶性肿瘤都存在多种基因突变，主要涉及致癌基因的激活和抑癌基因的失活，从而改变了整个基因组的表观遗传学[3]。目前通过高通量测序技术已经发现了大量与癌症发生和发展相关的基因[4-5]。在此研究基础上，基因编辑技术通过调节基因的表达和纠正基因突变，为癌症治疗带来了巨大的希望，导致精准肿瘤学领域的进一步突破[6]。

1 CRISPR/Cas9系统的简介

2020年诺贝尔化学奖授予 Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna两位博士，以表彰她们开发的CRISPR/Cas9基因编辑技术，该技术为精确的基因编辑提供了新的有力工具。第三代基因组编辑技术即CRISPR/Cas9技术，它是由细菌和古细菌中存在的抵抗病毒入侵、清除病毒基因组的Ⅱ型CRISPR/Cas获得性免疫系统经人工改造而成[7-8]。它包含Cas9蛋白，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）三个核心原件，为了使CRISPR/Cas9技术在实际应用中更为简便，Jinek等科学家将crRNA与tracrRNA融合在一起改造为依然具有引导Cas9蛋白识别靶点DNA序列功能的单链向导RNA（sgRNA）[9]。sgRNA通过碱基互补配对与靶序列相结合指导Cas9核酸内切酶切割目标DNA序列，造成双键断裂（DSBs）[10]。切割位点在“NGG”前间隔相邻基序（PAM）上游序列的第3个碱基对上，DNA双键断裂后引发细胞内的修复机制，即非同源重组末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）[11]。HDR修复需要同源模板链，可精确介导基因的修复和置换，NHEJ 修复途径则随机产生碱基插入或缺失突变[12]。与锌指蛋白核酸酶（ZFN）或转录因子激活样效应物核酸酶（TALENs）等应用较早的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、设计灵活、高效、成本较低等优点[13]，目前CRISPR/Cas9技术已成功实现基因敲除、基因修复、转录调控等操作，广泛应用于不同研究领域。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中取得的研究成果进行综述，为肿瘤发病机制和临床治疗的相关研究提供参考。

2 CRISPR/Cas9系统在肿瘤治疗研究中的应用

2.1 建立肿瘤研究模型

小鼠是恶性肿瘤研究中常用的动物模型，传统的胚胎干细胞打靶技术虽然适合在内源基因中产生复杂的遗传修饰，但其操作繁琐且耗时[14]。快速而精确的CRISPR/Cas9技术使研究人员能够通过特定的基因修饰创建癌症的小鼠模型，从而能够更客观地研究癌症的发生机制。目前直接将 Cas9 mRNA和sgRNA通过显微注射的方式注入小鼠受精卵中，在特定序列上产生DNA双链断裂从而形成定向突变的方法大大加速了转基因小鼠模型的生产[15]。比如通过流体动力尾静脉注射共表达Cas9蛋白和靶向抑癌基因Pten的sgRNA的pX330载体质粒到成年小鼠的肝细胞中进行瞬时表达，获得小鼠迟发型肝癌模型，并验证小鼠肝脏Pten基因被特异性敲除[16]。利用AAV病毒将针对Kras、p53和LKB1基因的sgRNA导入化脓性链球菌Cas9（SpCas9）小鼠的肺部，成功地建立了小鼠肺癌模型[17]。

患者来源的异种移植（PDX）动物模型可以使人类肿瘤外源性生长，为肿瘤学研究提供不可或缺的临床前工具[18]。小鼠是人类PDX模型最广泛使用的宿主；然而小鼠体积过小限制了异种移植肿瘤的生长，这对样本收集和药物评价造成了影响。因此，研究人员使用CRISPR/Cas9技术敲除了Spraogue Dawley（SD）大鼠的Rag1、Rag2和Il2rg基因，该SD-RG大鼠存在严重的免疫缺陷，免疫系统中缺乏成熟的T、B和NK细胞。利用该大鼠模型研究人员地建立了一种肺鳞状细胞癌的PDX模型，且移植肿瘤包含了原发肿瘤的组织病理学特征[19]。综上所述，与小鼠相比，严重免疫缺陷的SD-RG大鼠支持PDX的快速生长，因此具有作为肿瘤研究的新模型的巨大潜力。

2.2 靶向敲除致癌基因

细胞生长调控机制紊乱是肿瘤发生的主要原因。在致癌因素的影响下，原癌基因突变导致异常活化细胞生长信号通路被激活，幼稚细胞异常增殖，细胞成熟和凋亡受到抑制，从而导致肿瘤的发生[20]。体外研究表明，CRISPR/Cas9技术可以通过靶向敲除癌基因有效地抑制肿瘤细胞的生长。CRISPR-Cas9敲除CD133基因可减弱黑色素瘤的侵袭转移能力、降低基质金属蛋白酶MMP2/MMP9的表达水平[21]。用CRISPR/Cas9技术敲除miR-3064显著抑制了胰腺癌细胞的增殖、侵袭和致瘤能力[22]。此外，利用CRISPR/Cas9系统敲除癌基因EGFR的等位基因，发现肺癌细胞系H1975、A549和H1650的生长和增殖受到抑制，H1975或A549肺癌细胞的种瘤小鼠的肿瘤体积有所减小[23]。使用CRISPR/Cas9系统敲除KRAS突变的非小细胞肺癌细胞（NSCLC）中的FAK基因导致NSCLC细胞对放射治疗的敏感性增加[24]。这些研究表明CRISPR/Cas9 基因编辑技术可通过靶向敲除致癌基因，干扰相关蛋白的表达，从而抑制肿瘤的生长。

2.3 靶向修复抑癌基因

抑癌基因的沉默、缺失或突变会激活癌基因，导致肿瘤的发生和发展[25]。CRISPR/Cas9技术可以在体内和体外实验中快速验证抑癌基因，此外大量研究为通过CRISPR/Cas9技术纠正抑癌基因突变和治疗肿瘤提供了基础。恶性胸膜间皮瘤（MPM）中发现了抑癌基因神经纤维素2（NF2）的突变，与未经处理的细胞相比，NF2基因敲除的人间皮细胞系MET-5A显示出更强的迁移和侵袭能力[26]。且通过CRISPR/Cas9系统在肺癌线粒体融合蛋白2（MFN2）基因敲除细胞上观察到类似的现象[27]。通过CRISPR/Cas9技术使小鼠脑内多种肿瘤抑制基因（包括p53、Nf1、Pten和Ptch1）缺失，导致胶质母细胞瘤的发生[28]。这些研究表明，通过CRISPR/Cas9技术能够快速识别抑癌基因。

此外CRISPR/Cas9技术通过修复失活的抑癌基因在癌症治疗发挥作用。Moses等科学家使用CRISPR/dCas9联合反式激活剂VP64p65-RTA（VPR）激活癌细胞中低表达的PTEN基因。结果表明，通过dCas9-VPR系统，PTEN在黑色素瘤细胞中的表达水平升高，并且PTEN的激活明显抑制了下游的致癌途径[29]。Artegiani等人研究发现，利用CRISPR/Cas9技术使得正常人类胆管细胞中的BAP1基因丧失功能后，细胞变得异常活跃，并与其他器质融合，这一特征类似于肿瘤的转移性侵袭。有趣的是，他们恢复了BRCA1关联蛋白1（BAP1）在细胞核中的催化活性后，细胞恢复正常表型[30]。目前已使用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究肿瘤抑制基因的癌症包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌和宫颈癌、肝细胞癌等[31]。这些研究充分表明，使用CRISPR/Cas9技术进行基因修复或诱导肿瘤抑制基因的过度表达显示出癌症治疗的新潜力。

2.4 肿瘤的免疫治疗

肿瘤免疫疗法不是直接攻击肿瘤细胞，而是通过各种策略使机体发生适应性或先天性免疫应答来攻击肿瘤细胞。程序性细胞死亡分子1（PD-1）是一种存在于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面的膜蛋白，表达于许多肿瘤细胞表面的PD-L1和PD-L2配体与PD1结合后可抑制T细胞对肿瘤细胞的免疫应答，使肿瘤细胞逃避免疫系统的清除，阻断PD-1及其配体互作可恢复T细胞对肿瘤细胞的免疫应答[32]。因此，利用CRISPR-Cas9技术敲除包括PD-1基因和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）等，对于提高肿瘤免疫治疗的疗效至关重要。目前已有临床实验将CRISPR介导的PD-1基因敲除用于对前列腺癌、膀胱癌、肝细胞癌和转移性肾细胞癌的治疗，旨在进一步评估PD-1基因敲除在T细胞中的有效性和安全性[33]。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗开启了肿瘤治疗的新纪元，尤其是FDA 批准了Kymriah和Yescarta（B细胞白血病和淋巴瘤中CD19基因修饰的自体T细胞）为CAR-T细胞，分别用于急性淋巴细胞白血病和某些类型的非霍奇金淋巴瘤患者[34,35]。尽管广泛使用的自体CAR-T细胞在癌症治疗中具备良好疗效，但仍存在一定局限性，与CRISPR/Cas9技术的结合将优化CAR-T细胞疗法。同种异体通用CAR-T细胞应用于异体移植需要克服两个障碍即移植物抗宿主病（GVHD）和改善生物安全性以获得更强大的肿瘤靶向作用。为了解决这些障碍，研究人员使同种异体通用T细胞中的内源性α、βT细胞受体（TCRs）和人类固有白细胞抗原（HLA）分子沉默或破坏。在几项研究中，CRISPR/Cas9技术介导的TCRβ链和β-2微球蛋白（B2M）的多重敲除已被用于生产通用CAR-T细胞，结果表明，这些通用细胞在体外和体内都保持了功能，不会引起移植物抗宿主病[36-37]。在一项使用CRISPR/Cas9干扰粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的研究中，构建了GM-CSF缺陷的CART19细胞，其细胞抗肿瘤活性增强，总存活率提高。此外，在使用抗GM-CSF人源化IgG1 Kappa轻链抗体lenzilumab中和GM-CSF后，白血病得到持久控制，患者来源的异种移植物中的细胞因子释放综合征和神经炎症减少，研究者计划使用Lenzilumab和CART19细胞疗法的组合进行二期临床研究[38]。这些研究证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中的应用可行性。

2.5 修复表观遗传调控基因

在肿瘤细胞中表观遗传调控基因经常发生突变，导致基因表达紊乱[39]。DNA甲基转移酶和组蛋白修饰酶在恶性肿瘤细胞中经常发生突变，因此在基因水平上对表观遗传调控基因的编辑对纠正肿瘤表观遗传障碍尤为重要[40,41]。CRISPR/Cas9技术用于靶向特异性乙酰化转移酶p300激活中心，催化组蛋白H3赖氨酸的乙酰化，激活基因启动子和近端、远端增强子。即CRISPR/Cas系统通过靶向乙酰化转移酶活性的相关基因使其特异性激活从而调控靶基因转录[42]。因此，靶向编辑基因乙酰化酶为调控基因转录提供了有力的途径，靶向修复表观调控酶编码基因是肿瘤治疗的有力手段。

3 结语

目前，如要充分实现CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床中的应用，需要面临许多挑战，如编辑效率[43]、脱靶效应[44]，及如何高效的将CRISPR/Cas9系统成分导入目标组织等[45]，这对肿瘤治疗尤为重要，科研工作者正致力于对CRISPR/Cas9系统特异性及递送方法进行优化改进。CRISPR/Cas9基因编辑技术被广泛应用于肿瘤研究，但是目前大部分研究还处于初级阶段，更深入的技术还有待开发和应用。CRISPR/Cas9基因编辑技术在分子水平上仍存在许多与肿瘤治疗相关的问题尚未解决，这项技术必须经过严格的临床测试，包括有效性、安全性和特异性测试，确认其安全有效，然后才能投入临床应用。但不可否认的是，CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因层面上对肿瘤治疗具有极大的潜力，为肿瘤的治疗带来了希望，基于CRISPR/Cas9的个性化和靶向治疗可能是肿瘤治疗的发展趋势。