嵌合抗原受体T细胞治疗非小细胞肺癌的现状和挑战

顾玲 综述 魏霄滢，衡伟 审校

苏州大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，江苏 苏州 215000

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，晚期肺癌的5年生存率仅6%[1]。根据病理类型，可将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占总病例的85%以上[2]。尽管NSCLC治疗层出不穷，存在经典驱动基因突变的患者可口服靶向药物治疗，PD-1抑制剂为基因突变野生型患者带来长生存希望[3]。但是仍有部分患者既无可选择的靶向药物，也不能从程序性死亡受体1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡-配体1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制剂中获益，传统化疗疗效有限。因此，可选择的新的治疗方式对这部分患者至关重要。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞治疗是过继免疫疗法(adoptive cell therapy，ACT)之一。通过体外合成的工程化CAR修饰T细胞，使其能够靶向特定肿瘤抗原、识别肿瘤细胞，经过体外培养扩增后输注体内，可达到肿瘤个体化治疗效果。以CD19为靶点的第二代CAR-T细胞已被批准用于淋巴瘤和慢性粒细胞白血病的治疗[4]。实体瘤中，多项临床前研究发现CAR-T治疗有效，包括肺癌[5]、乳腺癌[5]、恶性间皮瘤[6]、恶性黑色素瘤[7]等。

1 CAR-T细胞结构

CAR-T细胞是工程化T细胞，其通过表达特异性载体CAR识别并清除肿瘤细胞。CAR是一种人工合成蛋白，由细胞外的抗原结合域、铰链区，跨膜域和细胞内的信号转导结构域构成[8]。CAR-T细胞通过胞外抗原结合域中的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)与靶细胞表面抗原结合，从而介导MHC非限制性肿瘤细胞杀伤[9]。铰链区可增加CART细胞的迁移能力[10]。胞内的信号结构域是一种细胞内T细胞激活复合物，其通过调节T细胞活化的下游信号级联触发抗原结合，通常包括一个激活结构域和一个或多个共刺激结构域[11]。CAR可分为五代，主要差异在胞内信号结构域，一代胞内信号转导结构域包含CD3ζ，二代包含CD3ζ和一个共刺激分子，三代包含CD3ζ和两个共刺激结构域，四代较其他不同的是加入一段活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)结构域，五代在二代的基础上加入一段IL-2受体β(IL-2Rβ)[8，12]。

2 NSCLC相关靶抗原

理想的靶抗原应该具有高覆盖率、高特异性及高度稳定，即该抗原为多数肿瘤细胞所表达且基本只存在肿瘤细胞表面，并且稳定存在[13]。不同实体瘤表达的肿瘤抗原有差异，NSCLC靶向抗原目前研究较多的是受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1)、PD-1/PD-L1、间皮素(mesothelin，MSLN)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)。

2.1 ROR1 ROR1是受体酪氨酸激酶样孤儿受体家族成员之一，在部分卵巢癌、三阴乳腺癌、肺癌中表达，且不在正常成人重要组织，如心、肺、脑、肝脏中表达[14]。NSCLC中，肺腺癌表达ROR1阳性率最高(ROR1+为42%)，鳞癌ROR1+占12%[14]。因此ROR1被认为可作为NSCLC CAR-T治疗靶点。在NSCLC 3D肿瘤模型中，有研究发现ROR1 CAR-T细胞可消除肺癌的大3D肿块[5]。然而在一项Ⅰ期临床试验(NCT02706392)中，发现NSCLC患者输注表达ROR1 CAR的自体CD4+和CD8+T细胞后，外周血中能检测到CAR-T细胞扩增，但肿瘤组织中CAR-T细胞浸润不佳，同时CAR-T细胞上调多种抑制性受体，且不产生γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)等抗肿瘤因子，最终未观察到实体肿瘤的消退[15]。尽管体外实验效果喜人，但在临床试验中并未取得阳性结果，如何使ROR1 CAR-T细胞在人体中发挥其杀伤肿瘤的作用仍需进一步研究。

2.2 PD-1/PD-L1 PD-1/PD-L1通 路 是T细 胞转归和功能的重要调节器[16]，PD-1/PD-L1结合可抑制T细胞活化，使肿瘤逃避免疫系统的监视。针对PD-1/PD-L1信号通路的药物在NSCLC中显示良好的疗效[17]。目前临床上最常见的是免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)，其通过靶向PD-1/PD-L1通路，破坏T细胞活化抑制信号，从而使细胞毒性T细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)重新识别和清除肿瘤[18]。而靶向PD-1/PD-L1的CART治疗正在研究中。研究发现，肿瘤细胞上PD-L1可与CAR T细胞上的PD-1结合，从而影响CAR-T细胞介导的体内外清除和杀伤肿瘤的能力，通过CRISPR/Cas9技术破坏T细胞上的PD-1，制备的CART细胞具有更好的治疗效果[16]。另外，QIN等[19]设计了一种包含针对人PD-L1的高亲和力单链可变抗体的抗PD-L1 CAR-T细胞，即CARPD-L1z T细胞，在体外实验中观察到CARPD-L1z T细 胞 能 分 泌 大 量IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α，并在NSCLC小鼠模型中两次输注CARPD-L1z T细胞后观察到肿瘤生长减慢。因此，除了ICIs，靶向PD-1/PD-L1的CAR T细胞治疗也有可能在肺癌免疫治疗中占一席之地。

2.3 MSLN MSLN除了在腹膜、胸膜腔、心包的间皮细胞上低表达，其他大多数人体正常组织中检测不到[20]，但在肺癌中高表达(60%～70%)[21]，因此被当作CAR-T细胞 治 疗 的 靶 点。YE等[22]将CAR-T MSLN细胞通过尾静脉输注肿瘤小鼠模型，发现靶向MSLN的第二代CAR T细胞可以抑制肿瘤生长，且随着效应靶比(effector to target ratio)的升高，抗肿瘤效果进一步增强。WANG等[23]进一步将CCR2b与MSLN-CAR共表达，制备CCR2b-MSLN-CAR-T细胞，发现CCR2b-MSLN-CAR-T细胞有强大的细胞毒作用并产生高水平的促炎细胞因子；另外将CCR2b-MSLN-CAR-T细胞输注于NSCLC CDX(cell line-derived xenograft，CDX)模型中，通过IHC分析发现CCR2b-MSLNCAR-T细胞与传统MSLN-CAR-T细胞相较，其向肿瘤组织迁移、浸润能力更强。尽管间皮素在正常组织中存在表达，但两例输注靶向MSLN的CAR-T细胞后未出现腹膜炎等靶向/非肿瘤毒性[24]，需进一步扩大样本量证实其安全性。

2.4 EGFR基因扩增和突变导致EGFR过表达，促进肿瘤复发、转移、血管新生，特别是NSCLC，其是NSCLC治疗的有效靶点之一[25]，因此，NSCLC也被认为可受益于EFGR CAR-T细胞免疫治疗。不少临床前研究发现EGFR CAR-T细胞在NSCLC中的抗肿瘤活性。LI等[26]发现EGFR CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后细胞毒性T细胞显著扩增、EGFR CAR-T细胞也持续增殖，体外试验进一步发现EGFR CAR-T细胞的特异性裂解活性、促进细胞因子分泌作用及CAR-T细胞数的增加；在小鼠模型中，观察到EGFR CAR-T细胞显著降低了肿瘤负担，且未观察到肺、心、肝、脾和肾等非肿瘤组织的的毒性反应。LI等[27]发现NSCLC患者血浆中CXCL13水平远高于健康对照组，且在肺癌组织中水平高于正常组织，CXCR5是CXCL13的唯一受体，基于此，构建了第二代CXCR5-EGFR-CAR-T细胞，并在体外试验和小鼠试验中观察到搭载了CXCR5的EGFR-CAR-T细胞较经典EGFR-CAR-T细胞向CXCL13阳性的肿瘤组织迁移作用增强，且对CXCL13阳性的肿瘤组织杀伤力增强。最近的一项Ⅰ期临床试验(NCT03182816)证明了EGFR-CAR-T细胞治疗EGFR阳性晚期复发/难治性NSCLC的有效性和安全性，疾病控制率为77.8%(7/9)，没有出现4级不良事件[28]，期待大样本数据进一步证实。

3 联合化疗增强CAR-T治疗的抗肿瘤疗效

含奥沙利铂(oxaliplatin，Ox)联合化疗被认为可以诱导和维持免疫原性，刺激机体免疫应答，加强抗肿瘤效应[29]。SRIVASTAVA等[15]通过分析经奥沙利铂/环磷酰胺(oxaliplatin/cyclophosphamide，Ox/Cy)处理的小鼠肺肿瘤的基因，发现参与内皮细胞炎症、固有免疫细胞激活和干扰素信号的相关基因显著上调，表明肿瘤微环境整体向促炎症状态转变，证明奥沙利铂用于肺肿瘤也可诱导免疫原性细胞杀伤；同时，CAR-T细胞联合Ox/Cy治疗显著增强肿瘤中CAR-T细胞的积聚，抗肿瘤效果优于单CAR-T治疗，且未发现联合Ox/Cy对正常组织的影响增强。

4 CAR T细胞免疫治疗的挑战

4.1 肿瘤免疫抑制微环境肿瘤微环境主要由癌细胞、免疫细胞(包括T细胞、B细胞、树突状细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞)、细胞因子、癌症相关成纤维细胞(CAFs)和细胞外基质构成，其中髓源性抑制细胞和M2表型肿瘤相关巨噬细胞起主要免疫抑制作用[30]；肿瘤细胞和髓样细胞通过表达大量吲哚胺2,3二氧化酶(Indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO)催化色氨酸降解为犬尿氨酸，犬尿氨酸的大量累积抑制CAR-T细胞的扩增、细胞毒性和细胞因子分泌；成纤维细胞和基质细胞通过分泌生长因子、趋化因子，促进肿瘤生长、转移和血管生成[12]。另外，缺氧、营养缺乏的肿瘤微环境抑制正常细胞的功能，但癌细胞可以通过积累代谢相关基因突变，使其优先摄取或摄取非常规来源的葡萄糖和氨基酸，以维持自身生长、增殖，并利用选择性代谢物影响正常细胞功能[31]。肿瘤微环境的各组成成分从物理屏障、体液免疫、代谢等多方面限制了CAR-T细胞在体内发挥抗肿瘤作用。

4.2 CAR-T细胞衰竭T细胞衰竭是在癌症中出现的一种T细胞功能障碍状态，可表现为功能失调、抑制性受体持续表达及不同于效应T细胞或记忆T细胞的转录状态，失去对癌细胞的控制能力(T cell exhaustion)。类似的，CAR-T细胞衰竭也在许多临床研究中被报道，一代CAR-T细胞对实体瘤无效。LONG等[32]进一步研究发现tonic CAR CD3ζ的磷酸化在CAR-T细胞衰竭中起核心作用，预示CAR-T细胞较T细胞更易出现衰竭。另外一些基础研究发现CAR共刺激分子CD28、c-Jun(一种典型的AP-1因子)缺陷、E3泛素连接酶Cbl-b介导T细胞衰竭，从而影响CAR-T细胞抗肿瘤效力[32-34]。

4.3 CAR-T细胞治疗的毒性反应CAR-T细胞治疗毒性发生机制可分为两个方面，一方面来自T细胞活化、细胞因子释放所致的全身毒性反应，常见的是细胞因子释放综合征(cytokine-release syndrome，CRS)，可表现为血清炎症性细胞因子水平升高、发热、低血压、缺氧和器官功能障碍[11]，与细胞治疗存在合理的时间关系，但较少出现在细胞治疗14 d以后[35]；CRS治疗上常使用IL-6受体单克隆抗体Tocilizumab来打破细胞因子的反馈回路，皮质类固醇也经常与托西利珠单抗联合使用[36]。另外较少见的全身性毒性反应有免疫效应细胞相关性神经毒性(immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS)和嗜血细胞性淋巴细胞增多症(haemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH)[11]。另一方面是CAR针对人体正常组织/非恶性肿瘤的靶抗原产生的毒性，称为靶向/非肿瘤效应[11]。尚未发现仅在肿瘤细胞生长上表达，且不在正常人体组织中表达的抗原，故在CAR-T细胞针对肿瘤细胞杀伤的同时，也会有正常人体组织损伤[37]。一项靶向抗羧基脱水酶IX(CAIX)的CAR-T细胞治疗转移性肾细胞癌试验中，发生2～4级肝酶升高，肝活检提示CAIX在胆管上皮上表达，伴有CAR-T细胞浸润，提示CAIX靶向CAR T细胞在体内产生抗正常组织上抗原的靶向效应，出现肝毒性[38]。另外有病例报道，靶向ERBB2的CAR-T细胞在治疗一例转移性肺癌后15 min出现呼吸窘迫，40 min后胸片提示肺水肿，继而出现严重低血压、心跳骤停，5 d后死亡[39]。该病例中检测到肺组织ERBB2的表达，故考虑是T细胞攻击肺组织出现的不良事件。但目前CAR-T治疗用于实体瘤的临床数据较少，无法统计相关靶器官的毒性。

5 总结

尽管非小细胞肺癌的CAR-T细胞免疫治疗正处在临床前研究及一期临床试验阶段，仍存在许多问题亟待解决。寻找特异性靶向NSCLC肿瘤细胞而肿瘤外毒性可忽略的CAR-T治疗靶点至关重要；通过联合治疗、多靶点修饰等方式加强CAR-T细胞浸润至肿瘤部位，增强抗肿瘤疗效。虽然困难重重，但是随着肿瘤治疗逐渐倾向个体化，工程化CAR-T细胞治疗仍是一种极具潜力的治疗方式，有望在肺癌个体化治疗中发挥作用。