大黄鱼分子育种相关技术研究进展

彭士明，王亚冰，王 倩，高权新，郑汉丰，许 建，王鲁民

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；2.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000；3.中国水产科学研究院，北京 100141）

大黄鱼是我国海水网箱养殖产量最高的鱼类，为了推进大黄鱼产业的高质量发展，我国诸多学者陆续开展了大黄鱼的良种选育研究，并取得了良好的进展［1］。大黄鱼优良品种＂闽优1号＂、“东海1号”和“甬岱1号”相继问世，有力推动了我国大黄鱼“育-繁-推”一体化产业体系建设。虽然通过群体选育、家系选育可以选育出具有优良经济性状的品种，但是传统的育种技术也存在周期长、效率低、预见性差等缺陷，极大限制了大黄鱼种业发展的步伐。

早在20世纪60年代，就有专家提出了基于分子标记开展选育的设想，然而这种当时超前的观点却并没有得到学术界的广泛关注［2］。到了20世纪90年代，DNA分子标记的价值逐渐被重视和挖掘，并且经过几十年的飞速发展，分子辅助育种技术逐渐成为引导全球鱼类育种革新的焦点。早期应用的DNA分子标记主要包括限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、微卫星标记（simple sequence repeat，SSR）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记等等。SSR和SNP标记因其具有多态性高、易于检测、遗传稳定性高等优点，逐渐成为全球分子标记辅助育种领域的主体技术。进入21世纪后，SSR和SNP标记开始用于大黄鱼的遗传改良研究［3-6］。

1 大黄鱼分子育种相关技术概述

随着高通量测序技术的飞速发展和低成本运营模式的推动，大黄鱼分子辅助育种发展迅速。新型的基因分型和分析技术不断涌现，并在大黄鱼育种研究中得以广泛应用。采用全基因组重测序（whole genome resequencing，WGR）和简化基因组测序（restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-Seq）技术可以挖掘出大量的SNP信息，这为SNP分型奠定了基础。然后，基于基因型数据可以构建高密度遗传连锁图谱，并用于数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）定位和全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）。目前，已经确定了一系列与大黄鱼经济性状相关的SNP位点，包括生长特性、抗病能力、性腺发育和抗逆性状等。基于这些SNP，分子标记辅助育种（marker-assisted selection，MAS）和全基因组选择技术（genomic selection，GS）已被用于大黄鱼育种。伴随着大黄鱼基因组的破译，得以在全基因组的水平上对目标性状进行关联分析，提高了人工选育的效能，加速了大黄鱼育种的进程［7-9］。我国现已开发了大量SNP标记，同时对重要经济性状进行了QTL定位和GWAS分析，这为大黄鱼品质改良和抗病抗逆育种提供了重要的数据支撑［10-12］。

2 大黄鱼分子育种相关技术研究进展

2.1 RAD-Seq测序技术

RAD-Seq技术于2007年问世，该技术是利用限制性内切酶将基因组进行酶切，并利用高通量测序技术进行序列检测。因为RAD-Seq技术不需要全基因组，因此该方法适用于所有的水产动物。RAD-Seq技术成本低，因此已成为基因分型和SNP标记选育的常见技术［13］。但该技术的主要缺陷是可能检测不到与目标性状相关的等位基因，因为这种方法的测序范围仅限于与限制酶位点相关的序列，这就导致基因组的很多区域不能检测［14］。LIU等［15］采用RAD-Seq技术在5个养殖及野生群体的120尾大黄鱼中发现了7 161个SNP标记，并指出在中国沿海水域的野生种群中，大黄鱼存在两个遗传谱系。ZHOU等［16］采用RAD-Seq技术分析了与大黄鱼生长性状相关的遗传信息，并结合GWAS技术发现了与体型显著相关的SNP和候选基因（bmp7、col1a1、col11a2和col18a1），这为开展大黄鱼的分子标记辅助选育提供了较为可靠的遗传标记。

2.2 遗传连锁图谱与QTL定位

遗传图谱是以基因连锁、重组交换值构建的图谱，显示与性状关联遗传标记的相对位置。待测物种的遗传背景必须是已知的，这是构建遗传连锁图谱的前提条件。迄今为止，已经构建了40多种水产养殖动物的高密度遗传连锁图谱，其中大多数水产动物的高密度连锁图谱是基于SNP或SSR 标记完成的［17］。早在2007年，NING等［18］就构建了首个大黄鱼遗传连锁图谱。近十年来，我国有关大黄鱼连锁图谱的研究逐渐增多，并为大黄鱼的分子育种打下了坚实的基础。YE等［19］基于大黄鱼的两个半同胞家系构建了遗传连锁图谱，发现了289个微卫星位点（93个EST-SSRs），共整合为24个连锁群，并在5个连锁群上检测到了7个QTL位点；AO等［20］构建了大黄鱼的遗传连锁图谱，总长度为5 451.3 cM，位点之间的平均距离为0.54 cM；KONG等［21］对大黄鱼的抗刺激隐核虫性状进行了QTL定位，并发现了4个与抗病性状相关的QTL位点和候选基因（ifnar1、ifngr2、ikbke和CD112）；ZHAO等［22］亦对大黄鱼抗刺激隐核虫性状进行了GWAS分析，在2个种群中发现了15个QTL和2个候选基因（casp8和traf6），上述研究为大黄鱼的生长和抗病性状的遗传标记选育提供了有效的序列信息。高密度遗传连锁图谱为大黄鱼精准定位、基因编辑和全基因组选择育种提供了重要的数据支撑。

经济性状多为数量性状且受多基因控制，传统的育种方法难以做到准确选择，因此构建高密度的遗传连锁图谱并进行QTL定位，可以开发出有效控制经济性状的遗传标记。一个数量性状的表型大多受多个基因的控制，而QTL定位的目的是确定导致该数量性状变异的相应基因位点。迄今为止，国内外已对近百种水产养殖动物进行了QTL定位，其中包括鱼类、软体动物、甲壳动物和棘皮动物，主要性状涉及生长、抗病能力、胁迫响应、形态性状、耐温性、肉质和性别决定等［17，23-26］。分子标记在构建大黄鱼遗传图谱方面的应用起步较晚，这在一定程度上制约了大黄鱼分子育种的发展。

2.3 GWAS分析

GWAS是在全基因组水平上开展大规模、多样本、反复验证的基因序列与目的性状的关联性分析技术，进而寻找与目的性状相关遗传因素的研究方法，以确定与性状相关的遗传基因。GWAS可用于分析数量性状和质量性状，包括识别新的变异性状，检测单基因和多基因控制的性状信息［27］。随着全基因组测序成本的降低，目前GWAS技术在水产领域应用逐渐增多，已被广泛应用于水产动物经济性状的遗传改良。涉及的主要性状有尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的性腺分化、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的肌肉产量［28］、凡纳滨对虾（Litopeneaus vannamei）的生长性状［29］、扇贝（Patinopecten yessoensis）的壳色［30］和虹鳟的抗病性状等［31］。

XIAO等［32］采用高通量全基因组测序技术完成了世界上首个大黄鱼全基因组物理图谱，并将大黄鱼的全基因组图谱组装成686张图谱，总长度为727 Mb，N50长度（126张图谱）达到1.7 Mb，这为深入研究大黄鱼生长、抗病、耐寒等性状的遗传机制和性状改良育种打下了坚实的基础。此外，国内的诸多学者已经运用GWAS分析获得了与大黄鱼生长性状、抗病性状、性腺发育、肌肉品质、性别指数性状和耐高温性状等关联的SNP多态位点、候选基因及QTL信息［22，33-43］，这为后续开展大黄鱼经济性状的遗传改良提供了重要的分子工具。通过大黄鱼经济性状基因位点或者等位基因的聚合和选育，可以全面提高养殖大黄鱼生产性能，促进大黄鱼增养殖产业的可持续发展。

2.4 全基因组重测序和分析

WGR技术可以对不同个体进行全基因组测序，全面解读基因组上的变异信息，从而计算该变异信息与经济性状的关联性。随着WGR价格不断降低，其应用也逐渐增多。但由于WGR的计算数据量非常大，所以对这些数据集的分析需要花费大量的时间，而且此类分析也需要较大的计算资源和存储空间。全基因组低深度重测序（low-coverage whole-genome sequencing，LcWGS）可以减少测序数据量并降低测序成本，通过基因型填充得到高密度SNP，并为基因组育种值（genomic estimated breeding values，GEBV）和GS提供帮助。ZHANG等［44］发现，对大黄鱼分别进行0.5x与8x的重测序，两者的精度相似，因此认为LcWGS适用于大黄鱼的GS。

近年来，随着许多水产养殖动物的全基因组被陆续破解，在水产养殖领域，WGR被广泛用于检测目的性状的遗传信息、环境适应机理以及选育效果验证，包括瓦氏雅罗鱼（Leuciscus waleckii）的适应性遗传分化［45］、鲤（Cyprinus carpio）的遗传多样性［46］、南方鲇（Silurus meridionalis）的性别连锁分子标记开发［47］、大西洋鲑（Salmo salar）的雄性发育、大菱鲆（Scophthalmus maximus）的抗病特性［48］以及点带石斑鱼（Epinephelus coioides）耐氨氮能力［49］等等。KON等［50］使用WGR技术对来自宁德和舟山的大黄鱼进行了遗传种群结构分析，发现了不同水域大黄鱼存在的遗传差异基因位点，并揭示了适应性驯化养殖所造成的遗传特征。WAN 等［38］针对大黄鱼变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）引起的内脏白点病开展了抗病性状的WGR分析，基于254 110个SNPs信息在3、5和20号染色体上发现了3个与抗病相关的候选区域，并发现了抗病性状的候选基因（IL10、THBS1、IGSF21、IGR、IGH、IRF8、TRAIL、CC、TNF和LINGO1）。

2.5 SNP芯片开发与应用

SNP芯片技术是开展大批量SNP基因分型的有效方法。与必须进行复杂文库制备和密集生物信息学统计处理的高通量测序技术相比，SNP芯片技术的操作流程和统计分析要简单得多。且大批量的测序无可避免的可能导致误差的产生，但是SNP芯片技术不存在这种问题，而且其可重复性较好。然而，SNP芯片也存在较大的缺陷，比如标记信息往往不全。由于SNP芯片标记主要是基于已测序品种的基因组序列开发的，而在育种过程中常常会引入外地品种、野生品种甚至近缘种群的优异基因组片段，因此现有育种芯片可能无法识别不同遗传资源中的特有变异序列，这也限制了外源片段的导入和识别。

SNP芯片分型技术更适用于具有完整基因组数据以及分子育种相对成功的物种，而测序技术更适用于新的水产养殖物种或处于育种初始阶段的品种。因此，未来进行基因分型的技术可能是将测序技术和SNP芯片技术进行有机结合，其技术成功的关键取决于物种遗传标记的有效性。ZHOU等［51］使用SNP芯片（NingXin-I）对5个种群96尾大黄鱼进行了效果评估，发现83.38% SNP具有多态位点，并确定了跨种群SNP的有效性为26.68%～56.23%。

2.6 全基因组选择技术

虽然在确定了主效QTL位点后，MAS可用于性状的强化选育，然而对于复杂的数量性状，分子标记的效果却十分有限，而GS可以作为一个更好的替代技术［52］。GS可以对物种全基因组位点的遗传效应进行全面估计，并使用多种分析方法生成一个方程来预测GEBV，最后将GEBV与实际表型值进行比较，使用具有基因型和表型数据的验证群体来评估预测方程的准确性。LIU等［53］对3 000多个群体进行生长性状的遗传力分析，准确率为80%。预测精度还取决于识别出的SNP的数量，也就是SNP密度越高越好，QTLs位点至少有一个SNP，这样SNP效应的估计就可以捕捉更多的遗传变异信息。QIU等［54］基于SNP标记的方法估计了9个数量性状的遗传参数，发现SNP数量降低时遗传力的估计值通常也会降低，体长、体高、体宽和内脏重之间存在较高的表型和遗传相关性。DONG等［55］评估了大黄鱼体质量、体长和肉质（n-3HUFA）的遗传力值，比较了不同计算模型的预测准确度，评估GS所需要的SNP的有效性，并着重指出将GS用于生长和肉质性状选育是完全可行的。董林松等［56］开发了基因组预测方法的两种新的计算策略和一种新的FBayesC预测方法，并将这些基因组预测方法用于大黄鱼经济性状的遗传改良研究，同时使用单标记分析和贝叶斯模型对大黄鱼的经济性状进行GWAS比较研究，研究成果不仅提供了节省基因组育种费用的方法，而且有助于推动大黄鱼基因组选择育种的进程。

2.7 基因编辑技术

如果可以确定控制性状的种内或种间变异的等位基因，那么运用CRISPR／Cas9系统编辑对性状不利或有利的等位基因，可以达到优化性状的目的。CRISPR／Cas9技术已经在很多鱼类中获得了成功，包括鲑科鱼类（大西洋鲑和虹鳟）、鲤科鱼类（Labeo rohita，Ctenopharyngodon idella和Cyprinus carpio）、鲶科鱼类（Ictalurus punctatus等）、太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）、尼罗罗非鱼和金头鲷（Sparus aurata）等［57-62］。

迄今为止，水产养殖动物基因编辑的主要目标性状包括不育化、生长性状和抗病能力等。基因编辑在水产养殖中应用广泛，主要原因是鱼类易于获得成千上万的体外受精胚胎，并且这些胚胎足够大，便于手动显微注射。使用大规模家系选育可以在一定程度上控制背景遗传效应，并且可以获得足够的样本量，以便将基因编辑与非编辑个体进行比较。目前尚未有CRISPR／Cas9技术在大黄鱼分子育种方面的相关报道，但是随着基因编辑技术的不断发展，CRISPR／Cas9技术应用于大黄鱼的良种选育也是可以期待的。另外，多基因性状对于基因编辑技术而言是一个严峻挑战，因为需要同时编辑关联同一性状的多个等位基因才能达到优化性状的目的，因此需要开发和改进多重基因组编辑方法。

3 展望

当今世界，高通量测序技术发展迅速，测序成本也急剧下降，基因组组装技术也更加精准，大黄鱼大量候选基因和遗传位点被发现和报道，为开展大黄鱼分子育种提供了坚实的基础。一些分子育种技术已经用于大黄鱼的良种选育，并取得了显著成效［63-64］。现代基因测序技术的发展推动了育种技术的革新，大黄鱼育种技术必然随着遗传学理论与技术的发展而不断进步。我国大黄鱼分子育种起步较晚，研究基础较为薄弱，但是我国大黄鱼种质资源丰富，市场需求量巨大，得天独厚的产业基础是推动大黄鱼分子育种发展的有利条件，具有广阔的发展前景。徐鹏等［65］先后开发了大黄鱼育种芯片“宁芯1号”和＂宁芯2号＂。大黄鱼分子育种技术的不断成熟和突破，将引发传统育种方式的重大变革。

种业是水产养殖产业可持续发展的命脉和根基，是国家“十四五”乃至今后相当长时间内水产养殖领域的核心攻关任务。当前，大黄鱼种业创新研发面临前所未有的大好形势。尽管目前我国在大黄鱼遗传育种领域已取得了一些重要进展，但在前沿育种技术领域仍存局限性，很多热点领域与技术有待发展和突破。首先，大黄鱼的基因编辑制种仍处于探索起步阶段。现在已经发现了大量与经济性状相关的主效基因，后续可以利用基因编辑技术对目的基因进行精准功能解析，并开展种质创制，从而达到优化性状的目的。第二，全基因组选择技术是一种基于全基因组范围的分子标记进行育种值计算和选择的高效育种方法，可大幅推广应用，并结合当今热点组学技术、人工智能设计育种方案，构建复杂性状的精准控制理论体系，驱动大黄鱼育种加速向精准化、高效化和智能化发展，从而为大黄鱼种业科技创新带来新的生机与活力。第三，肠道菌群作为新兴研究领域，对于大黄鱼的健康发育至关重要，并且与宿主基因和经济性状显著相关，今后可以构建“经济性状-肠道菌群-遗传基因”的一体化模型，为大黄鱼的种业创新提供新的理论视角与技术支持。