神经营养素对牙髓干细胞神经向分化的影响

薛 冰，席花蕾，姚丽红，徐婉秋，许晓航，王秀梅

牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是一类独特的间充质干细胞,来源于胚胎时期神经嵴的外胚间充质组织,与骨髓间充质干细胞有着相似的生物学特性,如多向分化、高度增殖及自我更新能力等,这些特性决定了DPSCs可以替代骨髓间充质干细胞，为神经性疾病研究提供更便捷的细胞来源[1-2]。Gronthos等在2000年采用酶消化法首次成功地分离出DPSCs并对其特性进行了深入的实验研究,发现DPSCs能够在mRNA及蛋白水平上表达神经前体细胞和胶质细胞的标志性产物——巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白,同时能分泌多种神经营养素(neurotrophin, NT)[3], Goorha等从脱落的牙齿中提取出原代DPSCs进行培养传代并在神经分化培养基下诱导,24 h后便观测到细胞呈神经元形态发展[4],这说明DPSCs具有神经向分化的潜能。Kang的实验采用3种不同的培养方案均成功诱导DPSCs分化出胆碱能神经元,当DPSCs暴露在不同的神经诱导条件下时,细胞开始神经向分化,其mRNA和蛋白表达与成熟神经元一致,证实了DPSCs具有神经向分化的潜能[5]。NT是一类由神经所支配的细胞或组织产生的蛋白质分子,可以分为神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)家族、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factors, GDNF)家族、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)细胞因子家族、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)家族等,NT既可以由DPSCs分泌表达,也能够影响DPSCs神经向分化中轴突的发生,支持神经细胞的存活[6-7]。近年来,NT在诱导DPSCs神经向分化过程中所扮演的角色得到了越来越多的关注,本文旨在对NT促进DPSCs神经向分化进行简单的总结归纳。

1 关于神经营养素家族的概述

1.1 NTFs家族

NTFs是一种分泌型蛋白质,能够促进轴突生长、神经细胞分化和存活,通过影响不同的靶细胞群,在周围神经系统和中枢神经系统中发挥着核心作用,NTFs包括神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3, NT-3)、神经营养素-4/5(neurotrophin-4/5, NT-4/5)等。由于NTFs在感觉和交感神经系统的发育中可以促进轴突的生长、帮助损伤的神经细胞恢复功能,所以常常应用于神经损伤的治疗中,其对早期神经元抗凋亡、保护轴突和髓鞘免受刺激性损伤有积极的作用,通过支持神经细胞的存活和发生发展来促进神经分化和调节神经生长[8-9]。

NTFs通过与相应的受体结合发挥神经营养作用。NTFs受体主要包括原肌球蛋白受体激酶A(tropomyosin receptor kinase A, TrkA)和神经营养因子受体p75(p75 neurotrophic factor receptor, p75NTR),其中TrkA是 Trk原癌基因产物,属于受体酪氨酸激酶家族,p75NTR属于TNF/Fas/CD40/CD30受体家族。研究表明,Trk基因家族由TrkA、TrkB、TrkC3个特征基因组成,TrkA为NGF高亲和力结合位点;TrkB对BDNF和NT-4的亲和力较高;而TrkC受体则主要与NT-3结合。p75NTR可以作为所有NTFs的低亲和力受体,但它与每种因子的结合特征略有不同,其激活可诱导细胞的存活或凋亡,具体取决于与p75NTR受体所结合因子的特性[10]。不同类型的NTFs通过与DPSCs表面相关受体结合,对DPSCs神经向分化产生不同的影响[11-12]。

1.2 GDNF家族

GDNF是一种能有效促进运动神经元存活和调节轴突生长的因子,其来源于神经胶质细胞,属于GDNF配体家族(GDNF family of ligands, GFLs),其成员还包括neuturin (NRTN)、artemin (ARTN)和persephin (PSPN)[13]。GFLs对中枢神经系统疾病、脊髓损伤后神经功能恢复及诱导干细胞神经向分化均能起到一定的促进作用[14]。

有研究表明GFLs 依赖于与复合受体结合来传递信号,复合受体包括功能性受体——跨膜受体酪氨酸激酶蛋白RET和特异性受体——GDNF家族受体α(glial cell line-derived family receptor α, GFRα),GDNF优先与GFRα1结合；NRTN则结合GFRα2；ARTN与GFRα3；PSPN结合GFRα4,GFLs与其对应的优先受体特异性结合后激活RET磷酸化,从而激活下游信号通路来发挥促细胞神经向分化的作用,如GDNF与GFRα1结合后激活了胞质酪氨酸激酶Fyn和FAK,这是施万细胞迁移和神经元轴突生长必不可少的部分[15]。GDNF与GFRα1结合激活RET磷酸化可促进神经元存活，同时还能保护培养的中脑多巴胺能神经元,起到运动神经营养功能,同时GFLs介导的信号级联在髓鞘形成、增殖和迁移中也起到重要作用[16]。

1.3 白细胞介素-6细胞因子家族

白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)是由单核巨噬细胞产生的，通常被认为是促炎细胞因子,然而,由于IL-6能够诱导神经元存活、增殖、分化和再生,影响神经递质突触的释放及神经活性,IL-6也可以被归类为NT[17]。IL-6属于一组四螺旋束细胞因子,其家族成员还包括睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)、抑癌素M(oncostatin M, OSM)、白细胞介素-11(interleukin-11, IL-11)等[18]。

IL-6信号传递是通过构建IL-6与跨膜型IL-6受体(mIL-6R)或可溶性IL-6受体(sIL-6R)及信号转导亚单位分子gp130复合物来传导的。IL-6在炎症性疾病及神经组织生理稳态中主要通过两条途径发挥效应,一种是经典信号传递——IL-6与mIL-6R结合激活gp130,进而激活下游信号转导；另一种是IL-6与sIL-6R结合构成反式信号传递,或通过IL-6R与附近定位细胞上的gp130结合反式递呈,激活JAK/STAT通路促进少突胶质细胞的分化。IL-6在发挥诱导细胞神经向分化的功能主要归功于sIL-6R[19-20]。

1.4 FGF家族

FGF是目前研究较多的生长因子之一, 已有实验证实其能够促进损伤神经的再生和髓鞘的形成,具有营养神经细胞、修复受损神经细胞的作用[21]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是FGF家族中最具有代表性的成员,其能通过影响神经细胞、施万细胞和成纤维细胞来促进轴突的生长,在维持神经元存活、抗凋亡和促进干细胞体外分化为神经元样细胞方面具有优越性[22]。

在bFGF诱导DPSCs神经向分化的过程中,主要是通过其特异性受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)激活PI3K/ATK信号通路,从而调控细胞的增殖和分化过程[23-24]。

2 不同种类NT对DPSCs神经向分化的作用

2.1 NTFs对DPSCs神经向分化的影响

Zhang等在实验中将DPSCs在单独或联合含有NGF和bFGF的培养基中处理后进行分析检测神经干细胞标志物——巢蛋白、微管相关蛋白-2、βⅢ-微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白的表达,结果表明,NGF或bFGF单独存在的培养实验中DPSCs均表达神经干细胞标志物,但与单独使用bFGF或NGF相比,bFGF和NGF协同促进DPSCs的神经向分化更具优越性[25],这说明NGF与bFGF均有利于DPSCs神经向分化。Tsutsui等认为DPSCs在NGF的诱导下具有修复脊髓损伤的潜力是由于NGF的表达影响了DPSCs分化为神经元细胞的能力[26]。Zhang等采用静脉注射的方法将BDNF与DPSCs共同注入缺血性脑卒中的大鼠脑内,成功促进DPSCs神经向分化,发挥了神经保护作用,并且提高了细胞的存活率[27]。总之,这些实验结果均可证明NTFs可以参与DPSCs神经向分化,调节神经元的可塑性以及神经细胞的生长和存活。

2.2 GDNF对DPSCs神经向分化的影响

Xiao等利用体外实验证实了GDNF介导DPSCs的增殖、分化主要是通过PI3K/AKT和MEK/ERK途径实现的,GDNF对DPSCs向神经及周围血管生成和分化都能起到一定的引导作用[28]。Sarhane等实验研究明确了GDNF能够诱导轴突延伸,促进神经纤维的成熟,靶向定位轴突生长,最大限度地改善诱导神经向生长的作用[29],在GDNF的诱导下DPSCs能够向神经向分化,并激活DPSCs分泌NGF、BDNF以及GDNF等促进神经营养因子。Ma等在研究中发现GDNF可以促进干细胞生长并使其分化为神经元样细胞,形成神经球样结构且表达神经细胞标志物,GDNF及NRTN在促进多巴胺能神经元的存活和形态分化, 增加发育中的多巴胺能神经元在体外的存活率,对防止运动神经元的凋亡能起到积极的作用[30-31]。这些实验均证明GDNF能够有助于DPSCs神经向分化。

2.3 IL-6细胞因子家族对DPSCs神经向分化的影响

Park等利用免疫荧光成像和Western blot对比了健康的DPSCs和炎性DPSCs在随着IL-6浓度增加神经向分化潜能的变化：随着IL-6的加入,健康DPSCs的神经分化潜能降低；炎性DPSCs的神经发生潜能随着中和IL-6的增加而增加,实验证明IL-6影响DPSCs神经向分化的潜能[32]。Ashwini等实验利用CsA介导的CN信号使IL-6表达增加,检测到干细胞表达神经前体标志物增加,进一步说明IL-6能够促进DPSCs神经向诱导[33]。Zeng等通过RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光显微镜等方法检测标记基因和蛋白的表达，观察到经CNTF诱导的DPSCs能够表达胆碱能神经元标志物——乙酰胆碱转移酶,证明了CNTF可以促进DPSCs向神经元样细胞分化[34]。总之,IL-6细胞因子家族对DPSCs神经向分化有着积极的作用。

2.4 bFGF对DPSCs神经向分化的影响

Zheng等将三维壳聚糖支架与bFGF联合应用于DPSCs,通过激活ERK信号通路成功促进了DPSCs神经向分化[35]。Alexander等利用含有bFGF和FGF等细胞因子的培养基培养DPSCs至第7代,检测到胶质纤维酸性蛋白、微管蛋白和少突胶质细胞标志物均呈阳性反应,这一结果清楚地表明,DPSCs经适当的生长因子处理后,具有分化为神经细胞的潜力[36]。在一些诱导干细胞神经向分化的研究实验中,诱导培养基中常会加入补充生长因子,在DPSCs的神经分化过程中bFGF可以作为一个强有力的补充生长因子,Hu等表示经bFGF预处理的DPSCs可促进神经特异性活化,在bFGF存在的情况下,DPSCs神经球大小增加,神经源性标志物表达上调[37],总之,bFGF能够促进DPSCs神经向分化,诱导神经突起生长。

3 总结与展望

经诱导后神经向分化的DPSCs具有保护神经、营养神经、血管生成以及免疫调节的特性,在神经再生修复方面有着巨大的优势,可以应用在许多神经系统损伤疾病的治疗中[38],如DPSCs可以作为治疗阿尔茨海默病的自体源干细胞，DPSCs产生多巴胺能神经元对治疗帕金森病有积极作用，DPSCs诱导神经向分化在脊髓损伤和坐骨神经损伤等周围神经损伤功能恢复方面有着显著的效果，DPSCs对脑卒中、视网膜修复、新生儿缺血缺氧性脑病等疾病也能发挥积极的作用,有望早日应用于临床治疗[39-40]。DPSCs神经向分化应用于神经损伤性疾病的临床治疗有着光明的前景,但仍有许多障碍需要克服,如DPSCs具体调控神经修复的机制尚不明确;特异性标志物不清楚;体外分化周期及速率难以把握;大部分的实验研究多为细胞或动物模型,应用于人体的改变尚未可知,风险目前无法预测。因此,对DPSCs神经向分化还需进一步研究和讨论。

利益冲突声明：无。