植物逆境生物学中的蛋白质组学技术运用探析

金勋，杨柳，李娜，潘红丽，芮海英

（黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江大庆 163316）

随着生命科学技术的日益成熟，对基因功能的探究早已不局限于核酸水平，其研究范围也在进一步拓宽与深入。在基因功能中，蛋白质是其执行者，也是表现生命现象的体现者[1]。要想进一步了解植物中复杂的生命活动，需深入研究蛋白质的整体水平。蛋白质组学是一门研究蛋白质组的学科，其本质是研究蛋白质的特征，例如蛋白质的表达状况，经翻译后的修饰及蛋白之间的相互作用等，具体获得蛋白质水平中关于细胞新陈代谢、组织变化等过程，为获得更为全面综合的认知，应把握好蛋白质的表达水平。目前，蛋白质组学发展迅速，并广泛应用与各个领域，现已成为生命科学研究的重要内容[2]。

植物在成长发育的过程中既会经受自然天气变化等非生物胁迫，例如高温天气、洪涝灾害、高盐等，也会经受病虫害等生物胁迫，常见的病原菌侵染及虫害是较为重要的生物胁迫因素。当植物遭遇生物、非生物胁迫后，可以通过信号接受及信号转导等形式，以调节植物细胞内关于抗逆相关蛋白的表达，通过生理状态的调整，以提高自身对逆境的耐受能力。通过定性及定量方法测量蛋白质的变化水平，以进一步探究植物在逆境胁迫机制下的调控机制，从而深入研究植物的抗逆性。

1 蛋白质组学概念及研究技术

1.1 蛋白质组学概念

蛋白质组学的研究对象为蛋白质，通过对蛋白质组成及其表达、修饰等的分析研究，了解蛋白质间的相关性及相互作用，并从整体上分析掌握蛋白质活动规律、对生命的影响等，进而探索和解释功能层面上的生命活动。蛋白质组学在已知基因表达中有重要作用，同时对探究植物抗逆境相关研究也有关键意义。

1.2 蛋白质组学概念及研究技术

以往，众多科学家注重定性分析蛋白质组，而随着蛋白质组学技术的发展，蛋白质组学的研究目的已经发生转向，即注重系统识别并定量分析蛋白质组。因蛋白的浓度对蛋白功能的实现产生一定的影响，所以需重视蛋白质绝对与相对浓度的测量。现阶段，定量测量蛋白质的方法主要分为两类：一类是传统双向凝胶电泳及染色，另一类是质谱检测技术。

1.2.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术。诞生于20 世纪70 年代的双向电泳技术具有诸多优点与特点，其高分辨率是该技术的特有优势所在，可分辨出1000～2800 个蛋白带点，随着技术的迭代与更新，该技术也在处于不断的优化与技术改进的过程中，当前应有较为广泛的双向电泳技术是双向荧光差异凝胶电泳[3]。该技术也存在一定的弊病，即操作过程耗费大量的时间、精力；蛋白质的分离容易受到多种因素的限制与影响；试验的重复操作性较差。

1.2.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术。质谱的蛋白质组学定量技术主要包括非标计定量技术与标记定量技术两大类，另外，标记鸟枪蛋白质组学策略及非标记的鸟枪蛋白质组学策略，这两种技术都是质谱技术的常用的方式与方法。质谱技术在蛋白质组学中占据关键位置，应用较为广泛，无论是蛋白质鉴定、定量或是描述，亦或是其他蛋白质相关研究均有该技术的应用。所谓质谱技术就是通过离子化样品分子并对其按照质荷比差异原理予以分离并确定质量的技术。质谱技术具有准确性高、实用性强的特点，在研究中得到了广泛使用和接受。具体而言，质谱分析的实现需要首先片段化或亲和层析，后使用酶将蛋白转化为多肽，并实现多肽分离，过程中选择高压液相色谱。

（1）标记定量技术。标记定量技术主要包括同位素代谢标记法、同位素化学标记法，两种标计定量技术各有其优点，例如同位素代谢标记法优点表现在，因蛋白质早在样本制备阶段的初期就已经被标记，因此能较大程度降低试验过程中出现的各种误差，有利于提高准确度。而同位素化学标记法的优势体现在：操作简单易行；应用范围较广；标记的效率较高，其准确率高，可用于标记不同类型的蛋白质；其反应的条件较为温和，因此其产生的副产物较少。但该技术也存在一定的弊端，其标记后的蛋白质样品较为复杂。

（2）非标记定量技术。非标记定量技术主要包括基于色谱峰面积定量法、基于二级离子信号强度实现多反应检测等。该技术是一种新兴的蛋白质定量方法，具有操作成本低、不费时费力等优点，但鉴于该技术对仪器的状态具有一定的依赖性，其精确度以与灵敏度要低于标记定量法，其未来发展过程中，还有待优化与升级，以逐步扩大应用的范围。

1.3 蛋白质芯片技术

蛋白质芯片技术是自动化蛋白质分析的一种，广泛应用于医学临床诊断和相关药物发现中，目前主要应用于蛋白与核算相互作用的研究及抗体的分析等领域中。

2 蛋白质组学在植物逆境生物学研究中的应用

自然界的植物生长受多种因子影响，其中既包括生物因子也包括非生物因子，若不利因素过多，将造成植物生长不良甚至死亡。与此同时，植物逆境胁迫响应机制不容忽视，植物在逆境下可通过生理应答、细胞应答等机制满足自身生长条件。分析和研究蛋白质组学在植物逆境生物学中的规律和表达能帮助人们更好地了解植物适应机制及相关胁迫因子伤害机制，从动态和整体层面加强对植物和蛋白质组学的了解。

2.1 非生物胁迫的植物蛋白质组学研究

2.1.1 温度胁迫。植物生长过程中温度起到极为关键的影响作用，直接关系到生长质量及产量。为更加深入了解植物在不同温度下的分析机制，当前研究加深了温度胁迫下蛋白质鉴定的分析。学者Laino 对Svevo 进行栽种并予以不同温度处理，以此分析热胁迫在硬质小麦粒中的作用及非醇溶谷蛋白积累。研究发现，有132 个表达发生相关变化的多肽，其中依靠基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱、基质辅助极光解吸电离飞行时间质谱对鉴定予以完整的有47 个。另外，研究发现，在热诱导的多肽中，多数会致使敏感植株发生反应。

2.1.2 干旱胁迫。抗干旱植物在荒漠化地区及年降水量较少的干旱地区需求量持续提升。植物生长于干旱环境下会通过关闭自身气孔抵抗水分不足问题，减少蒸腾，但是与此同时也会影响水分和无机盐等的运输。干旱条件下的绿色植物，其叶片会呈现发黄等失绿的情况，细胞的生长受到限制，蛋白质的合成量也呈降低的趋势。同时植物含水量的降低，影响植物的光合作用，其光合作用的速率降低。

2.1.3 水分胁迫。通过研究发现，研究人员已鉴定出水分胁迫响应关键因子，同时揭示植物应答水分胁迫所涉及到的代谢通路。有关学者将发芽的大豆置于水涝胁迫的条件下处理2d，从大豆的根部及下轴胚中提取蛋白质，在经过CBB 与SD-PACE 染色后，在凝胶中得到的可重复性蛋白800 多个。经研究发现，经水涝胁迫的大豆，约为20 个蛋白点出现表达量升高的情况，其涉及到的相关蛋白包括贮存相关蛋白、能量相关蛋白、初生代谢相关蛋白及信号转导相关蛋白、病害/防御相关蛋白中，大约7 个蛋白出现蛋白点表达量降低的情况，主要包括两类相关蛋白，即贮存相关蛋白与病害/防御相关蛋白。

2.1.4 盐胁迫。土壤中的盐分含量过高，会影响植物的生长发育，也是造成作物减产的重要原因，盐胁迫对植物的危害主要表现在2 个方面：即离子胁迫与渗透胁迫。植物通过传递蛋白激素酶信号，以感知盐胁迫，通过一系列信号转化及信息传递，改变离子水平。尽管盐离子会使植物体出现离子失衡的状况，却能在一定程度上通过上调膜转运蛋白表达量，以将盐粒子束缚在液泡中，或以某种方式排出盐离子，但总体而言处于盐胁迫环境下的植物，其正常的生命活动会遭遇到一定的干扰，影响植物的光合作用，植物的生命代谢活动也处于紊乱的状况。

2.1.5 营养胁迫。营养物质同样是影响植物生长的关键要素之一，充足的营养能帮助植物提升生长质量和产量。多数学者对植物生长过程中的营养胁迫加以研究，发现不同植物，或同一植物的不同株系在营养胁迫下的蛋白表现存在不同。以水稻为例，Nipponbare 株系和NIL6－4 这一近等基因系在根系蛋白质组中就存在差异，经质谱鉴定，在诸多蛋白点中，活性氧清除剂、植物防御反应蛋白等26 个蛋白参与了适应磷缺乏途径，说明了蛋白在控制磷缺乏适应性的重要性及途径。黑杨同样如此，经鉴定，在126 个被分离出的蛋白中，有20 个蛋白受到了钙胁迫的影响。

2.1.6 其他非生物胁迫。除以上几个因素外，臭氧、机械损伤及重金属等同样会对植物生长造成不良影响，产生非生物胁迫。在臭氧胁迫下，植物叶绿体中参与光合作用的蛋白将出现明显降低现象，而酶活性将在此背景下提升，说明在臭氧胁迫下植物光合系统可通过改变三羧酸循环功能影响植株碳分配。还有学者经蛋白质组学研究发现，在豇豆生长过程中，锰胁迫将抑制豇豆能量代谢。得出这一结论的原因是豇豆叶绿体经锰胁迫，其中光合作用相关及二氧化碳固定相关的蛋白丰度出现了显著降低。

2.2 生物胁迫的植物蛋白质组学研究

2.2.1 病原菌侵染。当病原菌侵染植物时，植物会出现局部的坏死，同时植物也会相应的产生一些抗病蛋白质，以对抗病原菌的情况。近年来，国内外诸多学者通过质谱技术对经过病原菌侵染的植物进行蛋白质组学的研究，以探究植物中相关蛋白表达量的增减。例如张晓婷等研究学者，利用MOLDL-TOF-TOF 质谱技术，对水稻感染品种及抗病品种在感染病毒前后的叶片进行研究发现，RSV 基因组编码的病害特异蛋白在水稻感染病品种的积累量要明显高于抗病品种，同时还鉴定出包括RSV 及NS2 在内的20 多个蛋白。

2.2.2 虫害。虫害是植物生物胁迫的关键内容之一，虫害的发生同样会造成植物死亡。以水稻为例，对水稻抗褐飞虱相关蛋白质进行筛选和分析可发现，水稻叶鞘中的多数蛋白质会在褐飞虱取食后的一段时间内产生明显变化，其中又以JA 合成蛋白质、β-葡聚糖酶及氧胁迫应答蛋白最为明显，这一结果正是对虫害在植物生长过程中胁迫作用的证实。

3 展望与发展

随着生命科学技术的发展，现在已然进入后基因时代，蛋白质组学相关研究也愈发深入，现已进展至植物抗逆研究，研究的不断突破弥补了传统植物生理学局限性。植物对环境胁迫的具体响应是一个极为复杂的过程，众多植物的相关生物学反应还有待探索。且有越来越多的研究发现，植物在自然环境下所遇到的逆境在多数时并非单一，而是多种逆境的叠加，故而相关研究可逐渐突破单一胁迫的束缚，开始向多种胁迫整合研究的方向发展。随着技术的迭代更新及相关数据库的建立与完善，植物基因组相关测序工作的完成，与抗性相关的基因与蛋白会得到更多的分析与研究，研究的深化与发展，也有利于更加综合全面的揭示植物抗逆性的本质与核心，从而为植物品种的培训工作奠定深厚的基础。