全悬浮ST细胞高效培养猪瘟病毒方法的建立与应用

夏 伟，宋松林，廉 维，王富猛，何玉友，董雅文

（吉林正业生物制品股份有限公司，吉林 吉林 132011）

猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）有包膜的正链RNA病毒。直径为40～60nm。CSFV以高热、高死亡率为主要特征，该病从发现至今一直困扰着我国养猪业健康发展，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。仅疫苗免疫这个环节就耗费了大量的人力和物力。猪瘟C株弱毒疫苗在国外被广泛应用，欧美地区猪群应用该疫苗已根除该病。但是，该病毒不引起细胞病变，且病毒难于培养，特别是猪瘟弱毒疫苗C株在转瓶培养过程中增殖很难，滴度大约在1×105.5TCID50/mL，迄今为止，猪瘟依然是危害我国养猪业最严重的疫病之一，而且在疫苗生产中也经常出现病毒毒价不稳定等问题。为了建立稳定生产猪瘟病毒的生产工艺，本试验驯化成功了全悬浮ST细胞，建立了无血清高效培养猪瘟病毒方法，为大规模稳定生产CSFV奠定了坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒和细胞 猪瘟病毒C株由吉林正业生物制品股份有限公司保存；ST细胞由上海源培生物科技股份有限公司驯化和保存。

1.1.2 猪瘟阴、阳性血清 猪瘟病毒阴、阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 CSFV的IPMA检测方法建立 将收获的CSFV病毒培养物按10倍系列稀释，接种ST细胞，培养72h，去掉孔内培养基，用PBS缓冲液进行洗涤3次，利用冰冻甲醇进行固定20min，弃掉甲醇溶液，用PBS缓冲液进行洗涤3次，进行毒价测定。

（1）浸板：每孔注入200μL的洗涤液，置室温浸洗一次，轻轻甩出洗液，吸水纸上轻叩。

（2）与血清抗体反应：将100倍稀释的猪瘟阳性血清，加入96孔板中，绕后反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1h。

（3）洗板：每孔注入200μL洗涤液，立即排除洗液，吸水纸上轻叩，重复3次。

（4）与酶标抗体反应：每孔注入100μL稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体，将反应板置入湿盒内，于37℃温箱中孵育1h。

（5）洗板：：每孔注入200μL洗涤液，立即排除洗液，吸水纸上轻叩，重复3次。

（6）底物显色：每孔注入100μL底物显色液（现用现配），于室温反应30min。

（7）终止反应：甩出反应液，每孔注入100μL蒸馏水冲洗一次，干燥。

（8）在显微镜下观察各孔显色情况，进行样品结果判定。

（9）CSFV阳性血清与病毒感染细胞染色后呈棕红色。

（10）CSFV阴性血清与抗原感染细胞无着色反应判定为阴性。

大多数人都在度假时想要去别处，包括那些自小生活在旅游胜地的人。英国人最喜欢的度假地是西班牙，因此5月和8月的公众假期，英国人会一下挤满西班牙的城市和海滩。在街上走半天，听见的净是英语。英国人会把家庭聚会或者告别单身的狂欢派对都搬去西班牙，狂呼痛饮，跟在英国凄风冷雨中那些死样活气一锥子扎不出一声来的英国人非常不同。人在异国，不必顾及面子。我的西班牙同事打算与众不同一下，在公众假期选择去都柏林。回来以后我问她都柏林怎么样，她说：“玩得很愉快，对城市印象很好，都柏林的吉尼斯啤酒比别处的都好喝。美中不足的是大街小巷都是西班牙人。”

1.2.2 ST细胞的全悬浮培养

1.2.2.1 细胞初始接种密度的优化 将ST细胞浓度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分别在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测。

1.2.2.2 补液方式的优化 分别采用半换液和逐步加液的方式在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测，观察ST细胞的生长状态，选择最佳的补液方式。

1.2.2.3 搅拌转速选择 分别选择60、80、90、100、120r/min的转速在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数、活力检测，观察ST细胞的生长状态，选择最适搅拌转速。

1.2.3 猪瘟病毒C株悬浮培养参数确定

1.2.3.1 接毒剂量的优化 按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒剂量，细胞浓度为50×104/mL的条件下进行培养，逐日观察细胞的状态，细胞计数和活力检测，在接毒后120h收获，并测病毒TCID50。确定最佳接毒剂量。

1.2.3.2 细胞浓度的优化 细胞浓度分别确定为20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接种5%猪瘟病毒，在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测，观察ST细胞的生长状态，在接毒后120h同时收获病毒，测病毒TCID50。确定最佳细胞浓度。

2 结果

2.1 CSFV的IPMA检测方法检测结果将收获的CSFV病毒培养物按10倍系列稀释，接种ST细胞，培养72h，去掉孔内培养基，用PBS缓冲液进行洗涤3次，利用冰冻甲醇进行固定20min，弃掉甲醇溶液，用PBS缓冲液进行洗涤3次，进行染色结果表明，CSFV阳性血清孔染出棕红色细胞，CSFV阴性血清孔未染出棕红色细胞，如图1所示，因此本试验建立的检测CSFV病毒的IPMA方法可以用于CSFV毒价测定。

图1 CSFV染色阳性

CSFV染色阴性

2.2 细胞初始接种密度的优化将ST细胞接种密度以20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，分别在生物反应器内进行全悬浮培养（见表1），结果表明，随着ST细胞培养时间延长，当细胞浓度达到1.0×107/mL以上时，细胞的生长速度显著变慢，且处于一个平台期不再生长，当细胞生长到1.0×107/mL以上时即使提高接种浓度细胞也处于停滞生长状态。

表1 不同ST细胞浓度对细胞生长的影响

2.3 补液方式的确定将ST细胞接种密度调整为40×104/mL开始在生物反应器中进行培养，分别在细胞培养到48h和72h时进行半换液和逐步加液的方式进行比较发现，在生物反应器中，分别在于48h和72h时更换50%培养基和逐步加液的方式，均可获得较高的细胞密度，也避免了营养成分过低和细胞代谢产物浓度过高对细胞生长的抑制作用，逐步加液的方式更有利于在生产实践中广泛应用。

2.4 搅拌转速确定将ST细胞接种密度调整为40×104/mL开始在生物反应器中进行培养，转速分别 定 为60、80、100、120、150r/min，结 果 表 明，120r/min的转速对细胞生长影响小，培养3d细胞生长密度可达到620×104/mL，因此，120r/min为最适搅拌转速（见表2）。

表2 不同转速对ST细胞生长的影响

2.5 细胞浓度的确定细胞浓度分别确定为20×103/mL、40×104/mL、60×104/mL、80×104/mL和100×104/mL，同步接种5%猪瘟病毒C株，在生物反应器中进行培养，在接毒后120h收获病毒，结果表明，细胞浓度在40×104/mL和60×104/mL时，猪瘟病毒C株病毒滴度可分别达到107.5TCID50/mL和107.2TCID50/mL即最佳细胞培养浓度为40～60×104/mL时，猪瘟病毒毒价最高（见表3）。

表3 不同ST细胞浓度对猪瘟病毒C株增殖的影响

2.6 接毒剂量的确定按照1%、2%、5%、7.5%和10%的接毒剂量，细胞浓度为40×104/mL的条件下进行培养，结果表明，5%、7.5%和10%的接毒剂量均能达到107.1～107.2TCID50/mL（见表4）。

表4 不同浓度猪瘟病毒C株接种剂量对猪瘟病毒增殖的影响

2.7 收毒时间的确定ST细胞浓度确定为40×104/mL，同步5%剂量接毒，在生物反应器中进行培养，在接毒后24h、48h、72h、96h和120h分别收获病毒，结果表明，120h收获的病毒滴度可达到107.1TCID50/mL。确定最佳收毒时间为120h（见表5）。

表5 不同收毒时间对猪瘟病毒增殖的影响

3 讨论

目前猪瘟病毒的生产主要采用原代细胞和传代细胞培养，但是病毒在细胞上的繁殖能力不强，直接影响病毒的最终滴度。猪瘟病毒在ST细胞内复制过程中，病毒滴度低是制约猪瘟病毒弱毒疫苗质量不稳定的主要原因，猪瘟病毒受到诸多因素的制约，难于繁殖，在试验过程中发现，牛血清中常常含有BVDV抗体，对猪瘟病毒具有较强的中和作用，不利于猪瘟病毒在ST细胞上复制，现在猪瘟病毒疫苗半成品生产也有应用微载体培养的报道，但是该方法应用的微载体小球价格昂贵，工艺不好控制，批间差异大，重复效果不好，细胞需求量大。并且还有牛血清成分，对猪瘟病毒培养都是不利的。为了解决这个问题，本研究采用全悬浮ST细胞无血清培养基高效培养猪瘟病毒，取代了传统的转瓶和微载体培养工艺，避免了牛血清对猪瘟病毒繁殖的影响，提高了猪瘟病毒的滴度，解决了猪瘟病毒难于生产的瓶颈问题，同时该工艺也能节约人力资源，减小猪瘟疫苗生产利用转瓶生产批间差异大的劣势，为相关猪瘟病毒多联疫苗的研究奠定了坚实基础，同时该工艺生产的猪瘟病毒弱毒疫苗，减少疫苗的用量，降低了猪群的应激，大大提高了猪群的生产性能。