木榄耐盐内生细菌分离及其16S rDNA鉴定

戴婧婷，林丽玲，范铭丰，张华峰，刘希华

（1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室，福建三明 365004；2.三明学院海峡理工学院，福建三明 365004；3.三明市土肥站，福建三明 365000；4.厦门市森林病虫害防治技术站，福建厦门 361004；5.三明学院资源与化工学院，福建三明 365004）

根据联合国教科文组织和粮农组织的不完全统计，我国的盐碱地面积为9 913万hm2，盐碱地占中国总耕地面积的10%[1]。为了缓解盐碱胁迫对植物生长和产量的负面影响，人们已经采用多种方法来培育耐盐的农作物。传统杂交育种周期长，见效慢，基因工程育种存在着不可预见的缺点[2]，而内生细菌与植物的互作提高了作物的自身耐盐能力，并克服了上述2种方法的缺点[3]，因而分离出能与植物互作且能提高作物自身耐盐能力的内生菌在耐盐农作物的培育中有着重要的作用。红树林区土壤及其植株体内外含有大量微生物[4]，但研究多集中在植物病原菌抗菌方面[5-7]，而红树林内生细菌在促生抗逆等方面的研究鲜有报道。木榄（Bruguiera gymnorhiza）是红树林的主要组成种类，该研究从木榄根茎叶中分离筛选鉴定耐盐碱菌株，为培育耐盐农作物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。木榄采自福建省厦门市南湖公园（24°26′N，118°04′E），采样时整株植物连根拔起，低温保存运输，运回实验室后，马上分离内生细菌。

1.1.2 试验试剂。基本培养基为LB培养基，NaCl浓度设置为10（对照）、50、100、150、200 g/L。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离和纯化。木榄内生细菌的分离方法参照小飞蓬耐铅内生细菌的分离方法[8]。

1.2.2 生理生化分析。对分离纯化的菌株进行革兰氏染色、接触酶反应、柠檬酸盐反应、吲哚试验和甲基红试验检验[8]。

1.2.3 分子鉴定。菌株基因组DNA用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒（天根）进行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海华大基因）进行PCR扩增。退火温度为52℃。选用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ4种限制性内切酶消化16S rDNA扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测，分析酶切结果。选取酶切不同类型的代表菌株送往杭州有康生物科技有限公司进行16S rDNA测序[8]。

测序后的序列在NCBI核酸数据库，进行BLAST比对分析，用Clustal X 1.83对同源性超过95%序列进行分析，用软件MEGA（7.0）利用Neighbor-Joining（NJ）法构建系统进化发育树[9]。

2 结果与分析

2.1 内生细菌分离

从表1可以看出，只有在木榄的叶部分离到耐盐的内生细菌，而且随着盐浓度的增加，所分离到的内生细菌数量也随之减少。

表1 木榄分离菌株情况

2.2 生理生化分析

对所分离的24株（50 g/L和100 g/L浓度中分离的）内生细菌生理生化分析结果表明，所有的菌革兰氏染色后是紫色的，为阳性菌；过氧化氢试验均产生气泡，为阳性菌；吲哚试验全部为玫红色，为阳性菌；甲基红（M-R）试验均为红色，为阳性菌；淀粉水解试验除了1个50 g/L的为深蓝色，为阴性菌，其余菌株为紫色、紫红色或无色，为阳性。

2.3 分子鉴定

49株供试菌株通用引物8 f和1492 r扩增出1 600 bp左右的单一条带，经过4种限制性内切酶消化分别产生1～4种图谱类型（图1），酶切图谱比对、组合分析后共获得5种遗传型（表2）。选取不同组合类型的代表菌株进行16S rDNA序列测定，测序结果上传到NCBI数据库，收集同源性高的序列。

图1 供试菌株16S rDNA PCR产物酶切图谱类型

表2 供试菌株16S rDNA PCR-RFLP图谱类型

利用MEGA（7.0）将秋茄和木榄内生细菌菌株与其同源性较高的菌株16S rDNA序列构建系统进化发育树（图2）。结合各菌株的遗传距离（图2）和菌株16S rDNA序列的Blast同源性（表3）进行比较分析，初步推断出L1为越南芽孢杆菌（Bacillus vietnamensis），L2为芽孢杆菌（Bacillus cereus），L4为白翎芽孢杆菌（Bacillus baekryun-gensis），L5为巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）。

图2 基于16S rDNA基因序列构建内生细菌系统发育树

表3 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

3 结论与讨论

该文通过不同盐浓度的LB培养基对木榄根茎叶耐盐内生细菌的分离筛选，共分离到24株耐盐内生细菌，结合生理生化分析、16S rDNA分子鉴定等技术，推断出所分离到内生细菌分别为越南芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、白翎芽孢杆菌和巴氏葡萄球菌。

一些研究人员观察到，用内生细菌接种植物可以在盐碱地环境下促进植物生长和发育[10]。内生细菌或通过合成大量甘氨酸甜菜碱等化合物，或通过诱导渗透保护剂和抗氧化蛋白的合成[11]，或通过合成低乙烯产生和抗氧化防御机制的快速激活来增强植物在盐碱地的生长[12]。有研究通过分离龙葵等耐铅植物的内生细菌并转接马尾松上，促进了铅胁迫下马尾松的生长[13]。因此研究从红树林分离耐盐的内生细菌，转接到其他植物上以增强其在盐碱地生长，是可行的，也具有实际应用价值。