我国婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染及溯源研究进展

费 鹏，史恩聪，姚继云，郝梦迪，张雅晴，段京瑶，刘海瀛，刘登科

（1.南阳理工学院张仲景康养与食品学院，河南南阳 473000；2.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030；3.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471000）

1 克罗诺杆菌对婴幼儿的危害

克罗诺杆菌（Cronobacter spp.），属于肠杆菌科，是一个具有高度遗传多样性的属，该菌属由7个种组成：阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）、丙二酸盐克罗诺杆菌（C.malonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（C.turicensis）、莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii）、康帝蒙提克罗诺杆菌（C.condimenti）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（C.universalis） 和都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis）[1]。在这7个种中，阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌能够导致人体严重的临床感染。婴幼儿，尤其是体重较轻的早产儿，一旦食用了被克罗诺杆菌污染的食品，就会导致严重的脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和败血症等疾病，并带来严重的神经系统后遗症，死亡率高达40%～80%，严重危害着婴幼儿的健康[2]。2002年，国际食品微生物标准委员会就将克罗诺杆菌列为了“严重危害特定人群生命、引起长期慢性实质性后遗症的一种致病菌”[3]。2004年，世界卫生组织将克罗诺杆菌列为婴幼儿配方乳粉中的A类致病菌，此后该菌的危害风险识别被高度重视[4]。

2 我国婴儿食品中克罗诺杆菌污染的现状

2.1 婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染情况

我国是婴儿配方乳粉生产和消费的大国，婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染不仅制约了该行业的健康发展，而且严重威胁着婴幼儿的健康。表1总结了近年来我国市售婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染情况[2，5-13]，2008—2019年，该来源的克罗诺杆菌的污染率为1.11%～23.08%，污染率有所下降，但未见明显规律，这说明婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染与生产企业个体的生产环境和卫生管理直接相关。此外，研究表明原材料、加工环境、运输及销售等环节都有可能污染克罗诺杆菌。同时，如果婴儿配方乳粉开封后保存不当，克罗诺杆菌也可以通过空气污染产品，并在婴儿配方乳粉中长期存活[13]。因此，为了避免克罗诺杆菌的二次污染，婴儿配方乳粉的生产和运输环节必须进行严格的消毒处理，产品冲调最好使用70℃左右的热水，从而尽可能地消除克罗诺杆菌对婴幼儿的感染途径。

中国婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌污染状况见表1。

表1 中国婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌污染状况

2.2 其他婴儿食品中克罗诺杆菌的污染情况

随着婴儿食品资源和种类的多样化，研究发现克罗诺杆菌不仅能够污染婴儿配方乳粉，其他的婴儿食品中也检测到了该致病菌。表2总结了2008—2018年10年间我国市售婴儿食品中克罗诺杆菌的污染情况，这些婴儿食品覆盖了奶片、婴幼儿饼干、婴幼儿谷物食品、婴幼儿米粉、婴幼儿面条和其他辅食。克罗诺杆菌的污染率从4.17%到27.3%不等，其中2018年陕西地区婴幼儿米粉中克罗诺杆菌的污染率高达27.3%。此外，与婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染率相比，其他婴儿食品中该致病菌的污染率普遍较高。这表明与婴儿配方乳粉相比，其他婴儿食品的原辅料、加工和运输环境及包装材料等的卫生清洁程度有待进一步提高，而应用于婴儿配方乳粉生产的法律法规及生产要求也应适用于其他婴儿食品。

其他婴儿食品中克罗诺杆菌的污染状况见表2。

表2 其他婴儿食品中克罗诺杆菌的污染状况

3 克罗诺杆菌溯源中方法及应用

3.1 脉冲场凝胶电泳分型

脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是基于细菌上限制性内切酶的作用位点分布建立的一种分型方法，其辨识度高，是细菌分型传统的方法之一[23]。Fei P等人[24]利用PFGE技术对市售的婴儿配方乳粉进行分型溯源研究，发现虽然市售的地点不同，但是来自同一地区的克罗诺杆菌具有更为相近的PFGE图谱。许龙岩等人[25]对分离自不同地区食品中的阪崎克罗诺杆菌进行了PFGE分型研究，结果表明，部分食品被PFGE图谱相近的菌株污染，认为PFGE可以用于食品中阪崎克罗诺杆菌的溯源。然而，并不是所有的克罗诺杆菌都具有Xba I或Sep I的限制性内切酶位点，且PFGE并不能对受试菌株进行鉴定，导致了一些假阳性的存在，这就给PFGE技术在溯源中的应用带来局限性。

3.2 多位点序列分型

多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分型的方法，这种方法通过特异性的聚合酶链式反应扩增技术对6～10个400～600 bp的管家基因进行扩增并测定其序列，将得到的序列信息在数据库中进行对比分析，得到其序列型，从而对分离株进行分型和溯源研究[4]。与其他分型方法相比，多位点序列分型技术操作简便，辨识度较高，能够进行种水平的鉴定，且具有高度的共享性，越来越多的研究者采用此项技术对克罗诺杆菌进行公共安全实践的相似性查询和溯源研究[26]。目前，已经建立了克罗诺杆菌多位点序列分型数据库（http://www.pubmlst.org/cronobacter），其中已包含3 164株不同来源的克罗诺杆菌，113 430个等位基因，759个序列型；此外，980株克罗诺杆菌已经完成了全基因组测序，所有的研究者都可以通过克罗诺杆菌MLST数据库分享研究结果，并和其他研究者的研究结果进行比较。因此，目前克罗诺杆菌分型和溯源的大量研究都采用此法。Fei P等人[24]利用MLST分型对分离自车间终产品和相应环境样品中的克罗诺杆菌进行了分析，并通过相关性分析发现在婴儿配方乳粉生产中喷雾干燥、流化床和包装过程是最易污染该致病菌的环节。通过MLST分析发现新生儿脑膜炎的发生与阪崎克罗诺杆菌序列型4（Sequence type 4，ST4）高度相关，ST1和ST83分别是分离自婴儿食品和其加工环境中的优势ST。此外，罗诺杆菌的序列型也与地域有一定的关系，如ST64是中国地区婴儿食品中克罗诺杆菌的优势ST之一，而这种优势性在其他国家并未体现[2，24，26]。然而，虽然MLST分型展示出来的系统发育关系能够一定程度上反映受试菌株全基因组的系统发育关系，但是MLST分型能够分析的生物信息学数据量较少，很难达到基于碱基层面的精确溯源。

3.3 全基因组分型

全基因组分型是最为理想的分子分型方法，可准确鉴定克罗诺杆菌属菌种、亚种。全基因组的高通量测序技术（二代测序）较一代测序相比，不仅保证测序结果的准确性，且成本较一代测序较低[27]。研究发现全基因组测序结合MLST分型技术面对相同ST型的克罗诺杆菌进行深度解析，如cog-MLST、SNP等分析，可以应用于克罗诺杆菌的溯源研究[28]。闫瑞等人[29]研究表明通过cog-MLST可对ST型相同但无相关性的菌株进一步分型，且对不同聚类与菌株分离国家及来源之间的密切相关性，结果表明，对于相同的ST克罗诺杆菌的溯源分析有较大的帮助。综上所述，基于Pub-MLST数据库从全基因组层面对不同来源菌株进行分析，更有利于克罗诺杆菌的溯源研究。然而，在实际的应用中，虽然二代测序较一代测序的费用大大降低，但是其费用仍高于MLST分型和PFGE分型，这也导致了此种方法目前没有被广泛应用。

4 结语

克罗诺杆菌的污染一直是困扰我国婴儿食品产业健康发展的难题。近年来，虽然一些严格的食品安全卫生管理措施被有效实施，婴儿食品中克罗诺杆菌的污染率也有所减少，但是仍然不能消除该致病菌对婴幼儿的危害。总结原因如下：①克罗诺杆菌具有较强的抗渗透压和耐干燥的能力，这使得该致病菌能够在婴儿食物中长期存活[30]；②克罗诺杆菌能够产生大量的生物膜，从而起到对自身的保护作用，减弱了消毒剂和抗生素对该致病菌的作用效果[31]；③目前我国婴幼儿脑膜炎的治疗侧重点并没有聚焦在是哪种致病菌导致的疾病发生，这在一定程度上切断了克罗诺杆菌的溯源链。在婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的溯源中，除了PFGE分型、MLST分型和全基因组分型以外，随机多态性扩增DNA也可用于该致病菌的分型，但是由于这种分型方法的结果和引物设计相关，因此很难达到资源共享且重复性较差[32]。此外，随着将样本检测结果和样品具体采集信息、主成分分析和聚类分析相结合[33]，婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的溯源将更准确。综上所述，对我国婴幼儿食品中克罗诺杆菌的污染情况和溯源手段进行总结和探讨十分必要，这有助于掌握该来源克罗诺杆菌的种群特征，并能够为婴儿食品的安全生产提供针对性的指导，以便从生产层面杜绝该致病菌的污染。