化妆品用马尾松花粉提取物提取工艺研究

蒋一博 杜可欣 陈 军 牟维林 于建伟 赵乐荣

(烟台新时代健康产业日化有限公司，山东 烟台 264000)

马尾松花粉是我国重要的针叶用材树种，其花粉具有产量大、纯天然的优点，有研究证明松花粉多糖能激活T、B淋巴细胞的增殖，其通过影响IL-1β刺激B细胞分化和分泌抗体，并刺激T细胞分化IL-2及干扰素C，刺激中性粒细胞，提高NK细胞杀伤活性，增强机体免疫功能。但由于松花粉的水溶性较低，为了使其可以在在化妆品各类剂型中更好的应用，通常采用松花粉提取物的形式添加，此法既丰富了松花粉的应用领域，同时也有助于提高活性成分的功效作用。

目前化妆品松花粉提取工艺常用方法主要有传统水煮法、萃取法、酶解法、酸(碱)浸提法、超声法、超临界流体萃取法、微波法和深成层发酵培养法等[1]，其中酶解法、微波法、超声法、超临界流体萃取法过程复杂、酸(碱)浸提法易破坏多糖结构[2]，发酵培养法耗时较长，结合传统水煮法和萃取法衍生出的水提醇沉法、醇提水沉发及油溶萃取法等较为方便实用。

1 材料与试剂

1.1 实验用细胞

巨噬细胞。

1.2 检测试剂

纯化水(自制)、乙醇(分析纯)、GTCC(Croda Singapore Pte Ltd)、马尾松花粉(采摘自浙江的千岛湖)、IL-1βELISA测定试剂盒(联科生物技术有限公司)。

2 提取工艺

2.1 醇提醇沉

①提取剂为75%乙醇，按照松花粉：乙醇料液比1∶30进行投料，50℃、40W、40KHz超声回流提取2h；

②过滤后对滤渣进行二次提取，收集两次滤液；

③60℃减压浓缩至浸膏状态，加入浓缩液重量3.5倍的浓度95wt%乙醇，搅拌5min，静置醇沉12h；

④醇沉液过滤，滤液60℃减压浓缩至浸膏状态，加入浓缩液重量12倍的1,3-丁二醇和浓缩液重量2倍的纯化水，再加入浓缩液重量0.02倍MTI，得松花粉提取物。

2.2 水提醇沉

①提取剂为去离子水，按照松花粉∶水料液比1∶30进行投料，50℃、40W、40KHz超声回流提取2h；

②过滤后对滤渣进行二次提取，收集两次滤液；

③60℃减压浓缩至浸膏状态，加入浓缩液重量3.5倍的浓度75wt%乙醇，搅拌5min，静置醇沉12h；

④醇沉液过滤，滤液60℃减压浓缩至浸膏状态，加入浓缩液重量3.5倍的浓度95wt%乙醇，搅拌5min，静置醇沉12h；

⑤醇沉液过滤，对滤渣喷淋无水乙醇，对滤渣进行冷冻干燥，研磨成粉，即为松花粉水提物,。

2.3 GTCC提取

①提取剂为GTCC(辛酸/癸酸甘油酯)，按照松花粉∶GTCC料液比1∶10进行投料，50℃、40W、40KHz超声回流提取2h；

②过滤后对滤渣进行二次提取，料液比1∶8，收集两次滤液；

③加入滤液量0.4%wt的苯氧乙醇，搅拌均匀后再次过滤，即为松花粉GTCC提取物。

3 实验方法

3.1 待检原料的溶液配制

①配制1%浓度的待检原料溶液

原液经0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，取100μl到9.9ml无菌超纯水中

②配制工作浓度(万分之一)的待检原料溶液

取以上配制好的1%浓度的待检原料溶液40μl，加3960μl培养液中，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

3.2 标准曲线的绘制

①浓缩的IL-1β标准品150μl加上150μl细胞瓶培养基，作为标准曲线的最高浓度(500pg/ml)。

②在每一个试管中加入150μl的细胞培养基。使用标准品的最高浓度做1:1系列稀释。

③移液，确保充分混匀，细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

4 数据

4.1 标准曲线制作

表1 不同浓度标准品OD值测定

4.2 不同样品处理后的OD值的测定

使用酶标仪主波长450nm，次波长630nm检测出OD值，根据标准曲线公式：

OD=0.714n(浓度)-1.398

计算出原液样品稀释万分之一后，其中含有1L-1β细胞因子的浓度见表2。

表2 培养上清的OD值

5 结果与分析

5.1 酶标仪检测后所有样品的OD值都比对照组偏低，说明松花粉提取物对抑制1L-1β细胞因子的作用较明显。

5.2 根据标准曲线计算出对照组和加样组后的1L-1β细胞因子浓度趋势，与对照组相比抑制率依次为样品2(10.81%)>样品1(10.25%)=样品3(10.25%)。

5.3 由此可见对比以上三种常用的马尾松花粉提取工艺，水提醇沉法更能保留其活性成分并在功效作用发挥方面具有更高的作用价值。

6 结论

巨噬细胞属于免疫细胞，参与到人体非特异性防卫(先天性免疫)和特异性防卫(细胞免疫),它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体做出反应[3]。

1L-1β是由活化的免疫细胞和一些基质细胞分泌的，具有多种生物活性，能介导调节免疫反应和炎症反应的小分子蛋白质和多肽，是一类非特异性物质[4]。1L-1β主要有单核-巨噬细胞产生，可刺激B细胞分化和分泌抗体，并刺激T细胞分化1L-2及干扰素C产生，刺激中性粒细胞，提高NK细胞杀伤活性，增强机体免疫功能，1L-1β还有拮抗RV的作用[5]，使用1L-1βELISA试剂盒和酶标仪可以快速有效的检测原料提取物对巨噬细胞分泌1L--1β细胞因子的影响，从而测试其在抗炎功效方面的作用，对筛选和验证功能原料的提取方法具有十分有效。