2株水产病原气单胞菌拮抗菌的筛选鉴定及生物学特性

龙 梦，樊慧敏，江 遥，夏洪丽，程 俊，喻大鹏，夏立群,4，鲁义善,4

( 1.广东海洋大学 深圳研究院，广东省水生动物健康评估工程技术研究中心，深圳市海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台，广东 深圳 518120； 2.深圳市大鹏新区科技创新服务中心，广东 深圳 518120； 3.中国科学院 水生生物研究所，湖北 武汉 430072； 4.广东海洋大学 水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江 524088 )

气单胞菌属(Aeromonas)是一类革兰氏阴性短杆菌，在自然界中广泛分布，是养殖水生动物暴发性传染病的重要病原菌，其中部分种类也是人—畜—鱼共患病原菌。在环境胁迫或条件合适的情况下，气单胞菌可引起鱼类，如青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、鲤(Cyprinuscarpio)、鲫(Carassiusauratus)等，贝类及虾、蟹类等发病[1]。气单胞菌属根据生长发育所需温度范围及是否有动力分为两大类，即嗜温有动力气单胞菌和嗜冷无动力气单胞菌。嗜温有动力气单胞菌包括嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、维氏气单胞菌(A.veronii)、舒氏气单胞菌(A.schubertii)等，嗜冷无动力气单胞菌仅包含杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)1种细菌[2]。气单胞菌可单独或几种细菌混合感染致病，引发出血性败血症、肠炎、腹水病、疖疮病等[3-5]。其中以出血性败血症危害鱼的种类最多、范围最大、流行季节最长及造成的损失最大，对我国淡水鱼类养殖造成持续性的威胁[6-7]。

目前，我国对气单胞菌病的控制方法主要有抗生素、化学药物和疫苗等，但大量使用药物带来的药物残留、耐药基因传播以及耐药菌的产生等问题，已严重危及环境和人体健康，而针对气单胞菌的疫苗当前我国批准的仅有嗜水气单胞菌灭活疫苗[8-10]。生物防治是利用拮抗菌抑制病原菌的生长繁殖，使有害微生物的密度低于其致病密度，从而达到防控疾病的目的。目前水产养殖中广泛应用的病原菌拮抗菌包括芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸菌、酵母菌等。其中芽孢杆菌以具有耐高温，耐酸碱，抗挤压，能分泌产生氨基酸、维生素等营养物质这些符合益生菌的优点以及分布范围极其广泛而受到重点关注，应用较为普遍的拮抗菌株有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等[11-14]。

已有研究表明，红树林沉积物中微生物种类和活性丰富，其中芽孢杆菌为优势物种[15-16]。鉴于深圳红树林沉积物的微生物目前尚未被系统研究和开发，笔者以深圳东涌红树林沉积物作为菌种分离来源，运用点种法和打孔法等筛选方法，筛选和分离6种常见病原性气单胞菌的拮抗菌株，并对筛选获得的2株抑菌活性较强、抑菌谱较广的拮抗芽孢杆菌进行系统鉴定和生物学特性分析，运用模式生物斑马鱼(Daniorerio)和气单胞菌易感宿主鲢验证拮抗菌的生物安全性，以期为水产养殖气单胞菌病的生物防治及相关生物制剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红树林沉积物，采集于广东深圳东涌红树林。试验用鲢(体长8～10 cm，体质量9～11 g)、斑马鱼(体长1.5～3.0 cm，体质量2～3 g)均购自广州市花都区某水产养殖公司。拮抗菌筛选用指示菌包括6种水产气单胞菌：鲢源嗜水气单胞菌4LNC202、乌鳢(Channaargus)源舒氏气单胞菌HYK1、团头鲂(Megalobramaamblycephala)源维氏气单胞菌IH317、鲢源中间气单胞菌(A.media)4LNC214、鲑源杀鲑气单胞菌BG、鲢源豚鼠气单胞菌4LNC210。目标拮抗菌抑菌谱测定用指示菌除以上6种气单胞菌外，还包括黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)源爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)HSA-1、鲢源类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)LL1、鲢源耶尔森菌(Yersiniaruckeri)YR1、罗非鱼(Oreochromis)源无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)WC1535等。这些菌株均分离自患病鱼体，并为本实验室保存菌株。

1.2 气单胞菌拮抗菌的分离与筛选

1.2.1 细菌的分离纯化

2019年9月13日于深圳东涌红树林采集表层沉积物(深度5～10 cm)，放入装有冰袋的保温箱并于12 h内带回实验室处理。取3 g沉积物加入无菌海水定容至30 mL(稀释10倍)作为母液，进而对母液进行10倍倍比稀释，形成1、10-1、10-2、10-3、10-4等5个梯度，每个梯度取100 μL于2216E固体培养基(蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，磷酸铁0.01 g，牛肉膏1 g，海水1 L，pH 7.4～7.6)无菌均匀涂布，每个密度3个平行。置于28 ℃培养箱中倒置培养24～96 h，挑取形态、颜色不同的单菌落，在2216E平板上划线纯化，培养至长出单菌落后，再次挑取单菌落于2216E平板划线纯化至获得形态颜色单一的单菌落，然后挑取单菌落于2216E液体培养基中摇菌培养24～48 h，菌液中加入无菌甘油至终体积分数为20%，做好标记保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 拮抗菌的筛选

以鲢源嗜水气单胞菌4LNC202、乌鳢源舒氏气单胞菌HYK1、团头鲂源维氏气单胞菌IH317、鲢源中间气单胞菌4LNC214、鲑源杀鲑气单胞菌BG、鲢源豚鼠气单胞菌4LNC210等6株病原气单胞菌作为指示菌，采用初筛和复筛的方法对以上红树林分离菌进行拮抗菌的筛选。

初筛：采用点种法对分离菌株进行初筛，将生长至对数期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均匀涂布于BHI固体培养基上，再分别吸取红树林分离菌菌液3.0 μL点种，等距离于同一平板重复点种3次，于28 ℃恒温培养箱培养24～48 h，记录出现明显抑菌圈的菌株。

复筛：采用打孔法对上述有明显抑菌圈的分离菌株进行复筛。同样以6种气单胞菌作为指示菌，将处于对数生长期[D(600 nm)=0.3～0.4]的指示菌菌液100 μL均匀涂布于BHI固体培养基上，用无菌打孔器在同一平皿上等距离打3个孔，孔径约6 mm，每个孔中加入80 μL经初筛发现有抑菌活性的拮抗菌菌液，然后将平皿置于28 ℃恒温培养箱培养24～48 h，观察并测定抑菌圈直径，选定目标拮抗菌。通过初筛和复筛，共获得2株对指示菌均具有较好抑菌效果的拮抗菌，即AH10和AQ1。

1.3 拮抗菌的鉴定

1.3.1 菌落形态观察

将菌株AH10和AQ1无菌划线于2216E平板，28 ℃培养48 h，观察菌落的形态、大小、表面、湿润度等。挑取平板上的单菌落，经涂片、固定和革兰氏染色，于显微镜下观察拍照，同时，挑取单菌落用电镜固定液固定，并于透射电子显微镜(日立,日本)下观察拍照。

1.3.2 生理生化活性测定

将菌株AH10和AQ1分别接种至2216E固体和液体培养基，28 ℃下培养约12～24 h至菌液密度达1×108cfu/mL，用细菌生化鉴定试剂盒(广州环凯微生物科技有限公司)进行接触酶、氧化酶、淀粉、苯丙氨酸、硫化氢、明胶、扩散生长、硝酸盐还原、西蒙氏枸椽酸盐、β-半乳糖苷酶、靛基质、赖氨酸脱羧酶、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇和VP生理生化指标的检测。

1.3.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析和系统发育树构建

16S rRNA基因序列克隆和系统发育分析：采用瑞真生物细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌菌株基因组DNA，以其为模板用细菌16S rRNA基因通用引物 (27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′)和gyrB基因引物(UP-1S: GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA，UP-2Sr：AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCC)进行目的基因扩增，扩增产物经电泳和凝胶成像系统观察拍照，呈现单一的目的条带，约为1.5 kb(16S rRNA基因)和0.7 kb(gyrB基因)。将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序获得序列在美国国家生物技术信息中心中经BLAST同源性比较分析，并利用MEGA X构建系统发育树。

1.4 拮抗菌生长特性分析

将密度为1×108cfu/mL的AH10和AQ1菌液以1∶100(体积比)的比例转接至100 mL 2216E液体培养基中，分别在24、28、32、37 ℃下恒温摇床中以200 r/min培养18 h，每隔2 h取250 μL菌液于96孔酶标板小孔中，每个样品设3个平行，于酶标仪中测定D(600 nm)；按上述方法，将一定密度的菌液按比例转接至初始pH为3、5、7、9、11的2216E液体培养基中，在测定的最适温度下200 r/min恒温摇床培养；按上述方法，将一定密度的菌液按比例转接至初始NaCl质量分数为0‰、5‰、20‰、35‰、50‰、65‰、80‰的2216E液体培养基中，在测定的最适温度和pH下以200 r/min恒温摇床培养，以确定最适生长NaCl质量分数。

1.5 拮抗菌抑菌谱测定

采用打孔法对AH10和AQ1对常见鱼类致病菌的抑菌谱进行测定，所用指示菌包括：鲢源嗜水气单胞菌4LNC202、乌鳢源舒氏气单胞菌HYK1、团头鲂源维氏气单胞菌IH317、鲢源中间气单胞菌4LNC214、鲑源杀鲑气单胞菌BG、鲢源豚鼠气单胞菌4LNC210、黄颡鱼源爱德华氏菌HSA-1、鲢源类志贺邻单胞菌LL1、鲢源耶尔森菌YR1、罗非鱼源无乳链球菌WC1535等。分别吸取对数生长期[D(600 nm)=0.3～0.4]指示菌菌液100 μL均匀涂布到BHI固体培养基上，用无菌打孔器在同一平皿上等距离打3个孔，孔直径约6 mm，每个孔中加入80 μL拮抗菌(AH10或AQ1)菌液[D(600 nm)=0.3～0.4]，然后将平皿置于28 ℃恒温培养箱培养24～48 h，观察并测定抑菌圈直径。

1.6 拮抗菌生物安全性分析

1.6.1 拮抗菌的耐药性测定

将AH10和AQ1菌液密度稀释至1×107cfu/mL，取200 μL稀释菌液，均匀涂布于2216E固体培养基上，用K-B纸片扩散法检测AH10和AQ1对9大类29种抗生素的敏感性，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、糖肽类、林可酰胺类、磺胺类和氯霉素类。根据杭州滨河微生物试剂有限公司的《纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准》判定拮抗菌对各种抗生素的耐药性。

1.6.2 拮抗菌对斑马鱼的致病性

试验用斑马鱼体长1.5～3.0 cm，体质量2～3 g，设3个试验组和1个对照组，每组设3个平行，分别在装有5 L曝气自来水的塑料缸中放入斑马鱼20尾，水温22～24 ℃。试验组分别腹腔注射50 μL密度为8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，对照组注射相同体积的磷酸缓冲盐溶液，连续10 d观察并记录斑马鱼的存活状态。

1.6.3 拮抗菌对鲢的致病性

试验用鲢体长8～10 cm，体质量9～11 g，设3个试验组和1个对照组，每组设3个平行，分别在装有10 L曝气自来水的塑料缸中放入10尾鲢，水温22～24 ℃。试验组分别腹腔注射100 μL密度为8×106、8×107、8×108cfu/mL的拮抗菌菌液，对照组注射相同体积的磷酸缓冲盐溶液，连续10 d观察并记录鲢的存活状态。

2 结 果

2.1 拮抗菌的分离和筛选

自深圳东涌红树林沉积物中共分离纯化细菌62株，经初筛，有9株菌对至少1种指示菌具有拮抗活性。对这9株菌进行复筛，筛选到2株对嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌6种气单胞菌指示菌均具有拮抗活性且拮抗活性较强的分离菌，将这2株拮抗菌命名为AH10和AQ1。

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 菌株的形态特征

分离菌株AH10接种于2216E固体培养基，28 ℃培养24 h，菌落直径约为1.0～3.0 mm，菌落不透明、干燥、呈乳白色、中间较厚、形状接近圆形、表面粗糙、边缘缺刻状(图1a)，革兰氏染色呈紫色(图1b)。显微镜下观察到细菌呈短杆状，透射电镜下观察到菌体完整形态，具有细胞壁等结构(图1c)。

分离菌株AQ1接种于2216E固体培养基，28 ℃培养24 h，菌落直径约为1.0～2.5 mm，菌落不透明、湿润、具有黏性、呈乳白偏黄色、向上隆起、圆形、边缘整齐规则(图1d)，革兰氏染色呈蓝紫色(图1e)。显微镜下观察到细菌呈短杆状，透射电镜下观察到菌体完整形态，具有细胞壁等结构(图1f)。

图1 菌株AH10(a、b、c)和AQ1(d、e、f)的菌体表型Fig.1 The phenotypes of strains AH10 (a, b, c) and AQ1 (d, e, f)a、d.在2216E培养基上的菌落形态；b、e.革兰氏染色；c、f.透射电镜下的菌体形态.a,d.colonial morphologies on 2216E agar plate; b, e.gram staining under microscope; c, f.mycelial morphologies under transmission electron microscopy.

以上结果表明，菌株AH10和AQ1均为革兰氏阳性杆菌。

2.2.2 生理生化特性

菌株AH10和AQ1的生理生化结果见表1。由表1可知，菌株AH10和AQ1能够利用蔗糖、葡萄糖和淀粉，不能利用半乳糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、山梨醇、甘露醇，接触酶反应、明胶试验、硝酸盐还原呈阳性，氧化酶反应、苯丙氨酸、硫化氢、赖氨酸脱羧酶、靛基质试验呈阴性。菌株AH10与AQ1的不同之处在于：AH10能够利用西蒙氏枸椽酸盐，β-半乳糖苷酶试验呈阳性；AQ1不能利用西蒙氏枸椽酸盐，β-半乳糖苷酶试验阴性。参照文献[17]和[18]，初步鉴定菌株AH10和AQ1为芽孢杆菌属细菌。

表1 菌株AH10 和AQ1的生理生化特征

2.2.3 16S rRNA和gyrB基因序列分析

通过16S rRNA基因克隆和测序获得AH10和AQ1的16S rRNA基因序列，经美国国家生物技术信息中心BLAST同源性比较分析，取同源性较高的基因序列通过MEGA X构建系统发育树，结果见图2。由图2a可见：菌株AQ1与贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34单独聚为一支；菌株AH10与贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)FJAT-45028、JJ-D34，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)YS52，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)MD33，暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)SCSIO 05746聚为一大支，但未能与某一种芽孢杆菌单独聚为一支。为准确鉴定AH10分类地位，运用菌株AH10的gyrB基因及其同源序列构建系统发育树(图2)。由图2b可见，菌株AH10与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)D3单独聚为一支。结合菌落形态、生理生化特征以及16S rRNA和gyrB基因的分子鉴定结果，确定分离菌株AH10和AQ1分别为解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。

图2 菌株AH10和AQ1的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1a.菌株AH10和AQ1基于16S rRNA的系统发育树；b.菌株AH10基于gyrB基因的系统发育树.a.16S rRNA phylogenetic tree of strains AH10 and AQ1； b.gyrB gene phylogenetic tree of strain AH10.

2.3 拮抗菌生长特性

温度、pH和盐度与解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1的生长关系见图3。2菌株在24～37 ℃下均能生长，随着温度的升高，生长速度明显增快，在32 ℃时达到峰值，之后有所下降，最适生长温度为28～32 ℃。2株菌在pH为5～7时能够正常生长，但过高或者过低的pH都将严重影响菌株的生长状态，最适pH为5～7。盐度与菌株解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1的生长成负相关，在NaCl质量分数0‰～50‰间，拮抗菌的生长速度随着NaCl质量分数的升高而降低，高于65‰时生长被完全抑制，其最适生长NaCl质量分数为0‰～20‰。

图3 菌株解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1在不同pH、盐度和温度下的生长曲线(平均值±标准差)Fig.3 The growth curves of B. amyloliquefaciens AH10 and B. velezensis AQ1 under different pH, salinities and temperatures (means±SD)

2.4 拮抗菌抗菌谱

解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1对10种指示菌的抗菌谱结果见图4。解淀粉芽孢杆菌AH10除对耶尔森菌YR1和无乳链球菌WC1535无拮抗活性外，对其他8种指示菌均有较强的拮抗活性，其中：对类志贺邻单胞菌LL1的拮抗活性最强，抑菌圈直径达24 mm；对6种气单胞菌的抑菌圈直径为14～23 mm。贝莱斯芽孢杆菌AQ1除对无乳链球菌WC1535无拮抗活性外，对剩下9种指示菌均有较强拮抗活性，其中：对杀鲑气单胞菌BG的拮抗活性最强，抑菌圈直径达32 mm；对6种气单胞菌的抑菌圈直径为24～32 mm。

2.5 拮抗菌对抗生素的抗性测定

解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1对28种抗生素的抗性结果见表2。解淀粉芽孢杆菌AH10仅对四环素耐药，对链霉素和呋喃妥因中度敏感，对青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星等25种抗生素高度敏感；菌株贝莱斯芽孢杆菌AQ1对四环素和头孢他啶2种抗生素耐药，对链霉素和呋喃妥因中度敏感，对青霉素、卡那霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、红霉素、万古霉素等24种抗生素高度敏感。

表2 菌株AH10和AQ1的药敏特性

2.6 拮抗菌对斑马鱼和鲢的致病性

菌株解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1对斑马鱼和鲢的致病性结果显示：分别以2×105、2×106、2×107cfu/g剂量的菌液腹腔注射斑马鱼，连续观察7 d，斑马鱼游动、摄食正常，未出现游动缓慢、打圈、离群独游、腹腔或体表出血等病理或死亡现象，并且对照组也未出现不正常或死亡现象；分别以8×104、8×105、8×106cfu/g剂量的菌液腹腔注射鲢，连续观察7 d，鲢游动、摄食正常，未出现游动缓慢、打圈、离群独游、腹腔或体表出血等病理或死亡现象，且对照组也未出现异常或死亡现象。该试验结果说明解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1对斑马鱼的半致死剂量>2.0×107cfu/g，对鲢的半致死剂量>8.0×106cfu/g，表明2株菌对斑马鱼和鲢的生物安全性良好。

3 讨 论

3.1 拮抗菌的来源

拮抗菌的来源在拮抗菌的筛选和应用上是非常重要的一环，目前大部分报道的水产益生菌和拮抗菌产品均来源于鱼类肠道、周边水环境、底泥等[19-20]，来源的局限性阻碍了水产界拮抗菌和益生菌的发现及开发速度，因而扩大来源，将目光转向微生物种类和活性丰富的海洋及极端环境，是获得更多新颖活性拮抗菌或益生菌的关键。红树林是热带或亚热带地区海洋和陆地环境之间的高产生态系统，其生长环境具有盐胁迫、高矿物组成、强还原性、强酸性、频繁潮汐、强风、高温、缺氧等特征，沉积物中的微生物种类丰富并进化出了特殊的生理代谢系统[21-23]。从红树林中挖掘具有活性的代谢产物已成为生物医药领域的研究热点[24-25]。金善钊[26]自红树林沉积物中分离筛选到草本植物菊芋的贮藏致病菌拮抗菌，为解决菊芋贮藏保鲜问题奠定了基础；胡芮[27]自红树林沉积物中筛选到2株纤维素降解芽孢杆菌；孙超等[28]自漳州九龙江河口红树林沉积物中分离到降解纤维素、几丁质和木质素的厌氧细菌等。这充分表明，红树林沉积物中微生物活性潜力较大，是进行功能微生物筛选和开发的重要来源。目前尚无自红树林中分离水产病原菌拮抗菌的报道。笔者首次以深圳东涌红树林沉积物为来源，筛选水产养殖中6种常见病原气单胞菌的拮抗菌，结果显示，自东涌红树林沉积物获得的62株细菌中有9株菌对至少1种气单胞菌展示出抑菌活性，其中2株(解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1)对6种气单胞菌均具有较强的抑菌作用。该试验结果表明，深圳东涌红树林沉积物中的芽孢杆菌种类丰富，这与已有研究结果[15-16]一致，说明东涌红树林沉积物是筛选水产病原菌拮抗菌的理想和重要环境来源。

3.2 拮抗芽孢杆菌的鉴定

通过表型鉴定、生理生化和生物信息学分析，笔者将菌株AQ1和AH10分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

贝莱斯芽孢杆菌最初分离自西班牙马拉加省贝莱斯河流的河口中，能够水解淀粉和酪蛋白，可利用糖原、乳糖、甲基α-D-糖苷和D-棉子糖产酸，不能利用D-松二糖、精氨酸和邻硝基酚-β-半乳糖苷[29]。菌株AQ1的生理生化特征与其具有显著相似性。16S rRNA基因系统发育分析显示，菌株AQ1在基因水平上与贝莱斯芽孢杆菌高度同源，与贝莱斯芽孢杆菌FJAT-45028、JJ-D34单独聚为一支[30-31]。基于生理生化特征及分子遗传分析，鉴定菌株AQ1为贝莱斯芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌在自然界中广泛存在，与枯草芽孢杆菌在形态和生理生化特性上相似，于1987年被Priest等[32]正式命名，其显著特性就是能够水解淀粉和明胶，是α淀粉酶和蛋白酶的常用生产菌株。鉴于解淀粉芽孢杆菌形态、培养特征多样而复杂，并且其与贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌等在16S rRNA基因水平上具有较高相似性，因此传统的分类学方法，包括形态、生理生化特征、细胞壁组成和16S rRNA序列等难以有效对芽孢杆菌菌种进行准确鉴定[33-34]。随着分子生物学技术的快速发展和基因测序成本的不断降低，保守管家基因或基因组序列进化分析被广泛用于分离芽孢杆菌的鉴定与分类，常用的保守基因有gyrA、gyrB和rpoB等[35-37]。笔者同时利用16S rRNA和gyrB基因对菌株AH10进行系统发育树分析，结合形态和生理生化特性，最终鉴定菌株AH10为解淀粉芽孢杆菌[38]。试验结果证实，gyrB基因的鉴定准确性远高于16S rRNA基因。

3.3 拮抗芽孢杆菌在水产养殖中的应用

已有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌具有广谱抗菌及促植物生长作用，能有效抑制多种植物病原菌，防控多种植物病害[30]。研究发现，从鱼肠道等处分离的贝莱斯芽孢杆菌，不仅能够拮抗病原菌，还对鱼的生长、免疫和抗病能力等有一定的促进作用。Yi等[39]自鲤肠道中分离到1株贝莱斯芽孢杆菌JW，可拮抗嗜水气单胞菌和副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)等水产病原菌，通过饲喂鲫，增强鲫的免疫力和对嗜水气单胞菌的抗病力；王金燕等[40]自仿刺参(Apostichopusjaponicus)养殖池塘底泥中分离到的贝莱斯芽孢杆菌DY-6，能够显著拮抗假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.)和多种弧菌等病原菌，并且投喂仿刺参可显著降低仿刺参的发病率；高艳侠等[41]自罗非鱼肠道中分离到贝莱斯芽孢杆菌LF01，其能够抑制多种鱼类病原菌，投喂罗非鱼后，能够显著增强罗非鱼的免疫和抗病能力，同时降低爱德华氏菌和假单胞菌等有害菌在罗非鱼肠道中的丰度，改善罗非鱼肠道菌群益生菌的比例和多样性[42]。与贝莱斯芽孢杆菌相似，解淀粉芽孢杆菌不仅是α淀粉酶重要生产菌株，还是常见的植物内生益生菌，在玉米、大豆和甘蔗等农作物中广泛分布，通过自身分泌的次级代谢产物来促进植物生长，增强植物的抗病能力[43]。在水产养殖方面，已有诸多研究报道了解淀粉芽孢杆菌的生物防治属性，其拮抗作用非常明显。朱芝秀等[44]发现，解淀粉芽孢杆菌对自病死中华鳖(Pelodiscussinensis)中分离到的4株维氏气单胞菌有显著的抑制作用，有望用于水产养殖动物维氏气单胞菌的防治；傅超英等[45]自大黄鱼(Larimichthyscrocea)及周边环境中筛选出2株淀粉芽孢杆菌，其对溶藻弧菌(V.alginolyticus)、杀香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida)有良好拮抗作用，对创伤弧菌(V.vulnificus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌、大肠杆菌(Escherichiacoli)、葡萄球菌(Staphylococcussp.)均有良好拮抗作用，安全性试验也表明，其对多种水产动物不具有致病性。

上述研究报道的拮抗菌多对气单胞菌中的2～4种具有拮抗作用，暂无对6种及以上的气单胞菌同时具有抑菌活性的拮抗菌的报道。笔者分离获得的解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、类志贺邻单胞菌和舒氏气单胞菌等6种水产病原气单胞菌均展示出明显的抑菌效果，且2株菌对斑马鱼和鲢的安全性良好。该发现填补了目前水产养殖中无可同时拮抗多种气单胞菌的拮抗菌及相关微生物制剂的空白，为水产气单胞菌病的生物防控提供了重要的微生物资源和理论基础。

4 结 论

气单胞菌是我国养殖鱼类最重要的病原菌之一，能诱发不同水产养殖动物产生多种疾病，常见的如出血性败血症和溃疡性综合征等。作为鱼类和贝类疾病的主要病原菌，目前尚无针对多种气单胞菌的有效生物防治方法。笔者获得的解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌对多达6种气单胞菌均具有显著抑菌效果，抑菌圈直径分别达14～23 mm和24～32 mm，对温度和盐度有广泛适应性，为广温广盐菌株，对大多数抗生素高度敏感，且对鱼无明显致病性，安全可靠。因此，这2株菌在水产养殖中具有巨大应用潜力和广阔应用前景。