稳定同位素技术在贝类产地溯源中的研究进展

康绪明，赵艳芳，谭志军，翟毓秀，丁海燕，盛晓风

( 中国水产科学研究院 黄海水产研究所，农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，山东 青岛 266071 )

食品安全是国家“健康中国2030”战略的核心组成，是我国政府和人民关注的焦点。海产品作为优质蛋白来源，其产量占全世界食用肉产量的17%，到2050年海产品增量在肉产品增量中的占比将达25%，成为我国乃至世界食品供给的重要组成，并成为缓解全球粮食危机的重要食物来源[1]。贝类作为世界范围内重要的海产品之一，其产业发展和地位不容忽视。消费者对贝类的关注重点集中在安全与营养品质两个层面[2]。作为滤食性生物，贝类易受重金属、毒素以及病原微生物污染，为贝类的食用安全埋下隐患[3]。此外，由于贝类营养品质的地域差异明显[4]，导致贝类产地造假已成为影响贝类产品质量安全的重要因素之一，如法国著名品牌生蚝“吉娜朵”被国产普通生蚝假冒，严重损害了企业和消费者的利益[5]。国际上，欧盟、美国、日本等国家和地区对食品的跟踪与追溯提出了严格要求[3,6-10]。近年来，随着人们生活水平的提高和消费者自我保护意识的增强，我国消费者对食品溯源制度的建立与完善也表达了强列意愿[11]。因此，构建有效的贝类产地溯源技术可以为提高我国贝类产品质量安全水平及其与国际贸易对接提供关键技术保障。

当前用于食品产地溯源研究的技术主要包括稳定同位素技术[12-14]、矿物元素分析技术[15]、红外光谱技术[16]、分子技术[17-18]、非靶向代谢组学技术[19]等。近年来，随着质谱技术的发展以及国内外的一些理论性探索，稳定同位素技术已成为国际上食品产地溯源与保护的前沿技术[12,20-21]，并获得官方认可[13]。笔者综述了应用稳定同位素技术对食品产地溯源的基本原理、水产品产地溯源过程中常用稳定同位素的变化机理，以及它们在贝类产品产地溯源中的应用进展，同时对稳定同位素技术在贝类产地溯源研究中应加强关注的一些问题进行展望，以期推动稳定同位素技术在贝类质量安全领域的研究与应用，为完善我国贝类质量安全追溯体系、贝类质量监管及生产区划等产业工作提供技术支撑。

1 应用稳定同位素技术对食品产地溯源的基本原理

生物体在生长过程中与环境保持着广泛的物质交换，生物分子中稳定同位素的分布受生物与非生物分馏的影响[22]。稳定同位素在生物体内的积累与变化除与物种有关外，还与其生存环境密切相关(水、大气、土壤、气候、地质等)[13]。例如：食品中有机质的氢、氧稳定同位素组成主要与来源地的水有关；而碳、氮稳定同位素则与当地气候条件以及农业活动有关；硫稳定同位素主要受地质因素、火山活动、离海洋的距离以及人类活动的影响；锶稳定同位素的组成则主要与基岩地质因素有关[13,22-23]。因而，稳定同位素组成已成为食品的一个天然属性，具有较强的区域指向能力，其差异可用来反映来源地环境的不同。稳定同位素不随食品的生产、加工等过程改变，能忠实记录食品的生存环境信息，是稳定同位素技术进行产地溯源的基本原理与依据。筛选与食品产地密切相关、受其他因素影响较小的稳定同位素是应用此技术对食品进行产地溯源的关键。

2 水产品产地溯源中常用稳定同位素的变化机理

目前水产品产地溯源研究中常用的稳定同位素包括碳、氮、氢、氧、硫、铅、锶与钕等[24-29]。不同稳定同位素的地域差异受取样季节、气候、地形、海拔高度、经纬度、生物代谢类型等因素的影响[23,30]。阐明稳定同位素的变化机理对进一步研究其在水产品产地溯源中的应用具有重要作用。

2.1 碳稳定同位素

碳在自然界中的稳定同位素有12C与13C。对陆源植物而言，其碳稳定同位素组成主要受控于植物类型(如C3植物、C4植物)、碳源(空气或水体中溶解的气体)、温度、降水、光照以及压力等环境因素[31]。对海源植物特别是作为贝类饵料的浮游藻类而言，其碳稳定同位素组成在不同藻种之间差异较大(表1)。此外，研究表明，不同海域营养条件的差异(如氮磷比的差异)不但会改变藻类结构，对其碳稳定同位素组成也会产生影响。同一藻种在不同生长时期其碳稳定同位素也存在一定变化[32-33]。藻类种间差异及结构演替将引起以藻类为食的贝类的碳稳定同位素的区域差异，进而可实现贝类的产地溯源。此外，碳稳定同位素在贝类的不同性别与组织间也存在明显的差异(表2)，这可能与组织间代谢速率的不同有关[34]。

表1 贝类主要饵料藻的碳(δ13C)、氮(δ15N)稳定同位素值

表2 贝类各组织δ13C与δ15N的平均值

2.2 氮稳定同位素

氮的稳定同位素有14N与15N。氮在动、植物的生命过程中发挥着重要作用，对水生动物而言，其氮稳定同位素组成主要与其饮食构成有关。海藻作为海洋食物链的最底层，在食物链的传递过程中，氮稳定同位素会出现一定程度的分馏。当前这一研究已广泛应用于水生动物营养级的评估[37]。此外，研究表明，藻类氮稳定同位素的种间差异较大(表1)，同种藻(如青岛大扁藻)氮稳定同位素也存在明显的地域差异[32,35]。这主要是因为温度、营养条件等因素可对藻类的氮稳定同位素分馏产生影响[33,35]。饵料藻的差异将导致贝类的氮稳定同位素组成呈现一定的区域差异。此外，值得注意的是，贝类的氮稳定同位素也呈现出一定的性别与组织间的差异(表2)，这可能与组织间代谢速率的差异有关[34]。

2.3 氢、氧稳定同位素

氢和氧是水的组成元素，氢、氧稳定同位素在示踪水循环过程中发挥重要作用。氢的稳定同位素有1H与2H，常用2H/1H表示稳定氢同位素组成。氧的稳定同位素包括16O、17O和18O，常用18O/16O表示稳定氧同位素组成[38]。由于环境温、湿度的差异，水蒸发过程中的分馏效应对δ18O与δ2H有一定影响[39]，使δ18O与δ2H呈现出自低纬度、低海拔的沿海区域向高纬度的山地区域降低的趋势[12,40]。鉴于水生生态系统的复杂性，对水生动物而言，在稳态水生稳定同位素模型前提下应充分考虑蛋白合成及代谢过程中水的氢同位素分馏。基于此应充分研究水体、蛋白以及脂质中的δ2H，并分别分析组织去除脂质前后的δ2H[41]。水生动物组织内的δ18O组成与其生存环境存在较好的对应关系，可应用于产地溯源研究。研究表明，氢、氧稳定同位素可用于海参产品的产地溯源，但应增加对氢、氧稳定同位素产生影响的季节、气候以及水生动物饮食构成等因素的探讨[27]。马东红等[42]应用氢稳定同位素对罗非鱼(Oreochromis)的产地进行了溯源，并取得良好效果。当前，为了获得更好的溯源效果，氢、氧稳定同位素常与其他指标结合使用[22]。

2.4 硫稳定同位素

自然界中的硫有32S、33S、34S以及36S 4种稳定同位素，其中32S与34S常用于食品溯源研究[22]。硫稳定同位素能有效保存并反映初始材料的原始特征，可作为理想的生物标志物来进行动、植物源食品的产地追溯[43]。然而，动物体内的硫含量较低，并主要来源于其饮食。动物体内的δ34S受当地饲料在其饮食中占比的影响，以致产地来源鉴定存在一定的不确定性。因此，目前δ34S仍仅作为辅助参数应用于动物源食品的溯源研究[39]。对水产品而言，淡水中硫酸盐的来源主要包括硫化物氧化、大气输入、人类活动输入等过程，不同来源硫化物的δ34S存在较大差异，这使利用硫稳定同位素对淡水产品的来源追溯成为可能。Camin等[25]利用δ34S结合δ13C、δ15N、δ2H及δ18O对意大利两个产区的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)进行了溯源，并取得较好效果。海洋植物将环境中的无机硫与体内的氨基酸结合，并最终通过摄食进入海洋动物体内。因此，海洋植物的平均硫同位素组成决定了海洋动物的硫稳定同位素组成，通过饮食引起的同位素分馏约为-1.0‰～0.5‰。整个海洋生物圈的δ34S范围相对较宽(16‰～20‰)，但局部的硫稳定同位素信号范围则相对较窄，基于这种区域差异可实现海洋动物的溯源。Nehlich等[44]研究了大西洋鳕(Gadusmorhua)中的δ34S，并发现δ34S呈现明显的区域差异，可实现渔业贸易路径的追踪。然而，目前为止还未见δ34S在海洋贝类产品产地溯源中的应用。

2.5 铅稳定同位素

铅的稳定同位素包括204Pb、206Pb、207Pb和208Pb 4种。其中206Pb、207Pb和208Pb分别是238U、235U和232Th放射性衰变的产物，其丰度在不断变化[45]。铅的来源分为以岩石的风化以及火山活动为主的自然源以及冶炼、汽车尾气排放为主的人为源[46]。因而，铅稳定同位素组成受地质结构、地质年代、矿物质含量以及大气沉降的影响而表现出一定的区域差异[23]。此外，由于铅稳定同位素的分馏作用较弱，短期内生物体的铅稳定同位素组成受外界条件变化影响较小，相对易受季节和气候影响严重的碳、氮、氧及氢等稳定同位素具备一定的优势[47]。Spencer等[28]研究了鱼类耳石中的206Pb/204Pb，发现鱼类耳石中的铅同位素特征不仅能反映环境的铅污染来源，还能用于鱼苗来源的追溯。但值得注意的是，由于人为的铅污染，近产区食品间的铅稳定同位素差异较小，导致溯源仍存在一定难度[48]。虽然贝类产品对铅有一定的富集能力，到目前为止尚未见应用铅稳定同位素对贝类产品溯源的报道。

2.6 锶稳定同位素

自然界中的锶有84Sr、86Sr、87Sr和88Sr 4种稳定同位素，其中87Sr是87Rb经过β衰变后的产物，放射性产生的锶同位素比用87Sr/86Sr表示。锶作为动、植物的一种重要的生命元素，主要通过其生存的土壤、水体及其饮食获取[39]。土壤的锶同位素信号主要取决于其年龄及土壤学特征(如酸碱性等)，而水体的锶同位素组成则受其溶解的矿物元素组成的影响[39, 49]。土壤及水体组成特征的差异通常引起87Sr/86Sr的不同，可通过研究动、植物样品的87Sr/86Sr组成进行产地追溯。应用87Sr/86Sr进行陆源动、植物产品产地溯源的一个关键优势在于其不受温度、气候、动物生理因素以及饮食过程的影响，在气候条件差异较小的邻近区域产品判别时相对其他易受气候影响的稳定同位素指标(如δ18O与δ2H)能发挥关键作用[27,39,49]。当前应用锶同位素进行水产品的产地追溯也开展了一些研究，如Yin等[29]通过研究梭子蟹(淡水种)、养殖水体及饲料的锶同位素组成，发现梭子蟹的锶同位素组成主要受养殖水体组成的影响，利用其区域差异可实现产地溯源。此外，锶同位素可用于淡水鱼的产地溯源也已被证实，但其用于海水鱼溯源的效果却不佳[49]。这一情况在海水贝类的溯源过程中也得到了印证，这主要与开放海洋以及近岸海水中87Sr/86Sr的高度均一性有关[26]。因此，在今后的海产品溯源中87Sr/86Sr仅建议作为辅助指标使用。

2.7 钕稳定同位素

自然界中的钕存在142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、148Nd和150Nd等7种稳定同位素，其中143Nd/144Nd常用于溯源研究[50]。环境中的143Nd/144Nd反映了当地的地质条件，这点与87Sr/86Sr较为类似。目前多用于考古研究领域，在生态研究领域应用则较少。钕稳定同位素在生态研究领域的优势在于以146Nd/144Nd(0.7219)为基准对143Nd/144Nd进行归一化处理后可忽略生理分馏对钕稳定同位素的影响。前期研究显示，海水中的143Nd/144Nd具有较大的区域差异，其主要受控于钕的源、汇以及海洋环流。这种差异因受河流以及风成输入的影响，在近岸区域表现尤为明显[50]。虽然海水中的钕含量较低，但却可以完整地记录在海洋生物体中。这主要是因为钕的离子半径与钙离子类似，其价态却高于钙离子，易取代生物膜上的钙离子位置并特异性地蓄积在鳃、肾脏以及肝脏等器官内[26]。因而，143Nd/144Nd具备作为海洋生物内在标记的潜力，有望在海产品的产地追溯上发挥重要作用。

3 稳定同位素技术在贝类产地溯源中的研究现状

当前，国内对水产品的溯源研究多集中在鱼类产品中[51]，对贝类产品进行产地溯源的研究相对较少(表3)，起步也相对较晚。贝类中稳定同位素的差异主要受其种类[52]、饮食结构(藻类结构)、新陈代谢等生理因素以及环境因素(气候、经纬度、温度、盐度等)[34-35]的影响，基于其差异可实现贝类的产地区分。当前应用于贝类产地溯源的稳定同位素主要以轻质稳定同位素(δ13C、δ15N、δ18O、δ2H)为主。近年来，重质稳定同位素(87Sr/86Sr、143Nd/144Nd)在溯源方面的潜力也得以受到重视。

3.1 轻质稳定同位素

目前，主要应用轻质稳定同位素(如δ13C与δ15N)对贝类进行产地溯源研究。贾亮亮[53]对鲍进行了产地溯源，并分析了采自大连的鲍的δ13C与δ15N。张旭峰等[52]分析了青岛、獐子岛、旅顺、长岛、莱州、牟平等地的虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、栉孔扇贝(Chlamysfarreri)与海湾扇贝(Argopectenirradians)闭壳肌的δ13C与δ15N，发现闭壳肌的δ13C与δ15N能有效区分不同产地来源的3种养殖扇贝。Zhang等[54]应用δ13C与δ15N对采自秦皇岛、蓬莱、乳山、青岛、旅顺、獐子岛、连云港等地的虾夷扇贝、栉孔扇贝以及海湾扇贝的种类及产地来源进行了研究，发现δ13C与δ15N的显著差异受产地、采样季节以及扇贝的种类等因素的影响。利用δ13C与δ15N对扇贝产地进行判别分析，判别正确率为92%，对扇贝种类的判别正确率高达98.3%。证明了稳定同位素技术在扇贝产地及种类判别方面的潜力。Zhao等[55]分析了秦皇岛、大连、蓬莱、烟台、青岛以及连云港等地虾夷扇贝中氨基酸以及单糖类物质的δ13C，发现丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖以及甘露糖的δ13C受季节影响较小。基于这10个参数构建的判别模型给出的判别准确率高达100%，表明在扇贝产地溯源时应用特异性化合物的δ13C能有效克服季节效应的影响。Zhang等[56]分析了秦皇岛、旅顺、獐子岛、蓬莱、乳山、青岛以及连云港等地虾夷扇贝、栉孔扇贝以及海湾扇贝的脂肪酸δ13C，并对其产地进行研究，发现判别正确率仅为85.3%，而结合脂肪酸组成后判别正确率可达100%。侧面反映了稳定同位素技术与其他技术联合应用的优势。

当前，氧、氢稳定同位素(δ18O以及δ2H)在贝类产地溯源上的应用则较少。为了对香港巨牡蛎(C.hongkongensis)进行产地溯源，才让卓玛[57]研究了汕头、惠东、珠海、台山、阳江、湛江以及钦州等地香港巨牡蛎全组织中的δ13C、δ15N、δ18O以及δ2H组成，脱脂香港巨牡蛎中的δ13C与δ15N，粗脂肪的δ13C以及外壳的δ13C，其中全组织、脱脂香港巨牡蛎中的δ13C与δ15N以及外壳的δ13C对香港巨牡蛎的产地判别正确率均高于92%。考虑到当前牡蛎壳(特别是品牌生蚝)存在造假的情况，排除外壳的δ13C，仅应用全组织、脱脂香港巨牡蛎的δ13C与δ15N进行联合判别，其产地判别正确率高达100%[57]。但该研究并未凸显出δ18O和δ2H的作用，这可能与该区域相对较小、气候差异不明显有关。

与国内相比，国外对贝类的稳定同位素研究主要集中在地质学、生态学以及考古学等领域。例如波兰学者通过研究新石器时代墓葬中蚌壳的δ13C与δ18O组成，对蚌壳的来源进行了追溯[58]。虽然这些研究并未直接用于贝类的产地溯源研究，但却为今后的研究提供了重要参考。

3.2 重质稳定同位素

当前，在贝类产地溯源中有较大应用潜力的重质稳定同位素主要为143Nd/144Nd。日本学者通过对日本东海岸区域的紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)、厚壳贻贝(M.coruscus)以及长牡蛎(Crassostreagigas)中的87Sr/86Sr与143Nd/144Nd稳定同位素组成研究发现，海水中的87Sr/86Sr较为均一，无法实现贝类的迁移行为研究。而海水中的143Nd/144Nd变化能较好地保存在贝类组织中，并呈现明显的区域变化，具备追踪贝类迁移行为的潜力[26]。Zhao等[50]通过研究日本及中国近海的贻贝可知，贻贝壳中的143Nd/144Nd与当地基岩中的143Nd/144Nd相匹配，在贻贝的产地追溯中具有较大潜力。虽然87Sr/86Sr在海水贝类溯源的表现并不乐观，但仍有学者将其作为辅助指标使用。如韩国学者研究了来自朝鲜、韩国以及中国的菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的δ13C、δ15N、δ34S、143Nd/144Nd以及87Sr/86Sr组成，指出多重稳定同位素分析结合线性判别分析可有效应用于菲律宾蛤仔的产地追溯[59]。根据前述87Sr/86Sr在淡水产品产地溯源中的表现，推断其可用于淡水贝类的产地溯源研究。

表3 基于稳定同位素分析的贝类产地溯源应用

4 展 望

4.1 加强稳定同位素在贝类体内分馏机制的研究

当前，应用稳定同位素对贝类进行产地溯源的研究多集中在溯源指标的探索方面，对贝类体内稳定同位素地域差异成因(分馏机制)的研究尚不多见。今后，在进行贝类产地溯源时，应重点探讨贝类组织、基因型、个体大小、食物(饵料藻)、采收季节、海水温度、盐度、底泥等因素对贝类中稳定同位素分馏的影响，以期在贝类体内稳定同位素分馏机制明晰的基础上筛选出更为稳定的同位素。此外，贝类主要生存于海洋中，一些陆生动、植物源食品以及淡水产品溯源用稳定同位素不宜直接拿来套用，应充分结合海洋环境的特殊性，探明其具体的稳定同位素分馏机制及适用性。对于当前虽未在贝类产地溯源中应用但具备一定潜力的稳定同位素(硫、铅及钕)，更应加强其分馏机制的探讨。

4.2 加强数据的深度挖掘、融合以及化学计量学分析应用策略的研究

食品真实性检测与溯源技术的构建常借助于化学计量学分析的应用。然而，当前对数据的挖掘、融合以及化学计量分析应用策略的研究仍然不足。针对贝类产地溯源研究，用到的统计分析技术除简易的单因素方差分析、邓肯多重比较分析、箱线图、散点图以及克鲁斯卡尔—沃利斯检验外，主要集中在非监督学习模型以及监督学习模型的应用(表3)。其中主成分分析以及聚类分析为非监督学习模型，主要用于数据的初步分析。而判别模型的构建则应用具备监督模式的学习模型，如线性判别分析。当前，在食品产地溯源中常用到的偏最小二乘判别分析以及簇类独立软模式分类法等具备监督模式的学习模型以及当前逐渐开始流行的随机森林树、支持向量机以及人工神经网络等现代机器学习算法还未见在贝类的产地溯源中应用[60]。此外，在模型构建前，对数据预处理方法的探讨仍然不足。因此，今后在利用稳定同位素技术对贝类进行产地溯源时，应加强对数据预处理的探讨、现代机器学习算法的引入以及多模型技术的融合。而在对不同产地溯源技术对比时，应考虑对比数据的一致性。此外，应考虑多重稳定同位素的应用与其他技术的融合，最终形成适用的化学计量学分析应用策略。

4.3 稳定同位素技术在贝类产地溯源过程中应加强关注的其他问题

尽管目前国内外应用稳定同位素对贝类进行产地溯源已取得了初步进展，但仍有一些问题值得关注，主要体现在：(1)贝类溯源品种不健全，高值贝类(例如鲍、牡蛎等)及其他涉及质量安全的蛤、蛏以及蚶等养殖贝类中的多数贝类尚缺乏产地溯源技术。(2)稳定同位素优势挖掘不充分，当前稳定同位素技术正面临一些新技术(例如分子生物学、组学技术等)的冲击，今后应深入挖掘稳定同位素技术的潜在优势，如加强特异性化合物稳定同位素在贝类产地溯源中的应用。(3)数据库的构建与共享不足，在当前大数据时代引领下应加快贝类稳定同位素的数据库构建与共享，在推进资源融合的同时能有效提升溯源准确度。(4)溯源效果的评价标准不完善，在评判一个溯源技术的好坏时，应充分结合样品量、产区数量以及距离的差异等因素，不应把溯源准确度作为判别溯源技术好坏的唯一标准。在不明显牺牲溯源准确度的前提下，检测费用低、耗时少的稳定同位素理应予以推荐。(5)应重视稳定同位素技术的缺陷，充分发挥其他指标的佐证作用，降低贝类产地误判的风险。