固定时间原核评估中0PN来源胚胎的发育潜能及其染色体整倍体率研究

赵海静，袁萍，赵珺，冀晓慧，张清学，王文军

(中山大学孙逸仙纪念医院生殖中心，广州 510120)

在常规IVF过程中，常通过原核出现来评估卵母细胞的受精情况。正常受精是指受精后16～20 h内观察到受精卵中有2个清晰的原核(2PN)和2个极体(2PB)[1]。不具备以上形态学特征的受精卵，如零原核(0PN)等被称为异常受精[2]。有11.3%～20.0%的成熟卵母细胞在显微镜下呈现0PN现象[3]。行IVF后第1天原核观察为0PN的成熟卵母细胞在后续的发育过程中会有两种结局：(1)没有发生分裂，处于未受精状态，我们称之为0PN卵母细胞；(2)能够继续发育到第1次分裂，即为0PN来源胚胎。根据欧洲人类生殖与胚胎学会实验室指南[2]，不建议移植0PN来源胚胎。但是，有很多研究者对0PN来源胚胎进行了大量的细胞遗传学分析发现，部分0PN来源胚胎为二倍体胚胎，并且有4.4%～37.2%的0PN来源胚胎能够发育为优质囊胚[4-6]。以上研究提示，在观察受精时没有原核的成熟卵母细胞可能实际上是含有2PN的受精卵，没有观察到2PN的主要原因可能是在固定时间进行受精评估很容易错过原核观察[7]。

正常受精的卵母细胞其原核消失大约发生在受精后的23～25 h，而发育速度快的胚胎其原核消失可能早于发育速度正常的胚胎[8-9]。所以，固定时间原核评估为0PN但能够继续分裂的0PN来源胚胎，也许是发育速度快的胚胎，只是在观察受精时原核已经消失。胚胎发育过程中的2个重要时间截点为：(1)从受精开始到原核消失的时间间隔称为tPNf；(2)从受精开始到第1次细胞分裂的时间间隔称为t2[10]。Kobayashi等[11]研究发现：(1)使用延时摄像(Time-lapse)监测系统进行原核评估时，0PN来源胚胎的发生率显著低于固定时间原核评估方法(0.0% vs. 8.3%，P<0.05)；(2)发育速度快的胚胎其原核消失早于发育速度正常的胚胎；(3)在固定时间原核评估时，0PN来源胚胎的t2显著短于2PN来源胚胎[(22.4±1.46)h vs.(27.3±3.32)h，P<0.05]，这说明0PN来源胚胎更早开始分裂，其发育速度更快；(4)通过Time-lapse观察受精后48 h内2PN来源胚胎的发育情况发现，t2和tPNf参数呈现正相关，提示原核消失越早细胞开始分裂越早，发育速度也越快；(5)移植0PN来源囊胚能够获得健康婴儿。因此，大部分0PN来源且发育速度快的胚胎是由于原核消失早，导致固定时间观察时错过了原核的出现，因此被错误地判断为0PN来源胚胎。在我们中心常规使用固定时间原核评估方法，可能错过原核观察而出现一定比例的0PN来源胚胎。本文拟通过比较固定时间原核评估中的0PN来源胚胎和2PN来源胚胎的Day 2(D2)和D3卵裂球数及其囊胚培养结局，从形态学特征来探究0PN来源胚胎的发育速度及发育潜能；并通过比较IVF-0PN来源囊胚与植入前遗传学检测-单基因病(PGT-M)周期中2PN来源囊胚的染色体整倍体率，从遗传学角度评估0PN来源胚胎的真实染色体状态。本研究为分析0PN来源胚胎的临床应用价值，提高胚胎利用率提供了理论依据，也为0PN来源胚胎的临床移植提供参考。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2019年10月至2020年9月于本中心行常规IVF治疗的20对不孕不育夫妇的临床资料。

纳入标准：(1)控制性促排卵方案为长方案；(2)D1原核观察为0PN或2PN。排除标准：(1)D1原核观察为1PN、3PN或多PN；(2)D1卵母细胞形态学观察为MI、GV、退化或空透明带。

共纳入20个周期的183枚卵母细胞。行IVF后D1固定时间原核评估，没有原核的成熟卵母细胞共67枚(0PN卵母细胞14枚，0PN来源胚胎53枚)，2PN来源胚胎共116枚。剔除14枚0PN卵母细胞后，根据原核评估以及细胞分裂情况分为两组：0PN胚胎组(0PN来源胚胎，n=53)和2PN胚胎组(2PN来源胚胎，n=116)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：入组患者均采用长方案进行促排卵。阴道B超监测卵泡生长情况，当B超监测有1～2个卵泡直径≥18 mm时，给予肌肉注射HCG(珠海丽珠)10 000 U，注射后36～38 h在阴道B超引导下穿刺取卵。在体视显微镜下收集卵泡液中的卵丘卵母细胞复合物，并置于G-IVF液(Vitrolife，瑞典)中培养。

2.精液收集及处理：取卵当天男方以手淫法采集精液，待精液液化后，通过密度梯度离心及上游法处理，从而获得符合IVF受精要求的优质精子。

3.IVF及原核观察：获得的卵母细胞经培养4～6 h后行IVF，加精浓度为0.3×106/ml。授精16～20 h后评估原核情况，受精卵中出现两个原核的为2PN，未见原核的为0PN。

4.胚胎培养及发育评估：去除颗粒细胞后，将胚胎转移至G1-plus培养液(Vitrolife，瑞典)中，置于37℃、6%CO2、5%O2培养箱中培养至D3。依据之前文献标准[12]，在D2和D3分别进行卵裂期胚胎的发育评估，并重点关注卵裂球数量。在D3将胚胎转移至G2-plus培养液(Vitrolife，瑞典)中进行囊胚培养。在D5和D6分别评估囊胚发育情况，依据Gardner评分系统[13]，综合囊胚扩张状态、内细胞团和滋养层细胞的发育情况对囊胚质量进行全面评估。根据囊胚腔的大小和是否孵出将囊胚发育分为6个时期：1期为早期有腔室囊胚，囊胚腔体积<胚胎总体积的1/2；2期为囊胚腔体积≥胚胎总体积的1/2；3期为扩张囊胚，囊胚腔完全占据了胚胎的总体积；4期为囊胚腔完全充满胚胎，胚胎总体积变大，透明带变薄；5期为正在孵出，囊胚的一部分从透明带中逸出；6期为孵出囊胚，囊胚全部从透明带中逸出。处于3～6期的囊胚，还需对内细胞团和滋养层细胞进行质量分级。其中，内细胞团分级：A级为细胞数目多，排列紧密；B级为细胞数目少，排列松散；C级为细胞数目很少。滋养层细胞分级：A级为上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级为上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级为上皮细胞层由稀疏的细胞组成，细胞很少。本中心定义可利用囊胚为透明带扩张程度≥3期，且内细胞团和滋养层细胞评分至少1项优于C级；优质囊胚为透明带扩张程度≥3期，且内细胞团和滋养层细胞评分为BB及以上。

5.囊胚活检：对D5或D6的可利用囊胚，使用30 μm活检针(Cook，美国)轻轻吸入5～6个滋养层细胞并通过激光切割法获得活检细胞，再将活检细胞装入含5 μl磷酸盐缓冲液(江苏亿康基因)的无RNA/DNA酶的小管中，储存于-80℃冰箱待进行植入前遗传学检测以分析染色体状态。

6.观察指标：比较两组间胚胎发育潜能情况，包括D2和D3卵裂球数、囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率以及染色体整倍体率。囊胚形成率=形成囊胚数/培养囊胚数×100%；可利用囊胚率=可用囊胚数/形成囊胚数×100%；优质囊胚率=优质囊胚数/形成囊胚数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、夫妻双方的一般资料

本研究共纳入20对不孕不育夫妇。女方平均年龄为(33.70±5.95)岁，平均获卵数为(14.85±9.47)个；男方平均精子正常形态率为(3.83±1.54)%，平均精子顶体酶活性为(55.20±29.48)μIU/106精子(表1)。

表1 纳入研究夫妻双方的一般资料(-±s)

二、两组间胚胎发育潜能比较

0PN胚胎组D2卵裂球数、D3卵裂球数、囊胚形成率、可利用囊胚率均显著高于2PN胚胎组(P<0.05)；0PN胚胎组的优质囊胚率略高于2PN胚胎组，但差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组间胚胎发育情况比较[(-±s)，%]

三、不同来源囊胚的染色体整倍体率比较

为了分析0PN来源胚胎的染色体是否正常，我们对0PN来源囊胚进行滋养层细胞活检及染色体筛查。根据不同来源囊胚分为两组：0PN来源囊胚为0PN囊胚组(n=42)，选取同一时期的PGT-M周期中2PN来源囊胚为2PN囊胚组(n=251)。比较两组间染色体整倍体率发现，0PN囊胚组的染色体整倍体率略高于2PN囊胚组，但差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 不同来源囊胚组间染色体整倍体率比较[(-±s)，%]

讨 论

原核观察是目前评估受精与否的常用方法，然而由于雌雄原核的不同步发育会导致固定时间的原核观察不完全准确。因此，在适当时间内未观察到原核，并不一定提示受精失败[1]。受精时表现为0PN但能够继续发育到第1次卵裂，即为0PN来源胚胎[11]。

0PN来源胚胎是源自于正常受精或异常受精很难确定。Lim等[14]研究发现，在合子期丢弃的0PN来源胚胎中有66%是二倍体，这说明一定比例的0PN来源胚胎实际上是2PN来源胚胎。原核的误判主要原因是由于在固定时间原核评估很容易错过原核的出现[7]。Kobayashi等[11]通过Time-lapse对胚胎进行连续监测发现，发育速度快的胚胎其原核消失要早于发育速度正常的胚胎，因此使用固定时间原核评估时，发育速度快的胚胎因原核已经消失而错过原核观察，从而被误判为0PN来源胚胎。这一结论支持了我们的研究，本文结果显示，0PN来源胚胎D2和D3的卵裂球数均显著高于2PN来源胚胎(P<0.05)，这说明0PN来源胚胎的发育速度快于2PN来源胚胎，而这些0PN来源胚胎很可能源自于正常受精，因原核消失得早，导致固定时间原核评估时未观察到原核。有研究认为，发育速度快的胚胎拥有更高的发育能力[15]。Fu等[16]研究也发现，快速发育的0PN来源胚胎有更好的发育潜能。Kobayashi等[11]研究发现，原核消失较早的胚胎其囊胚形成率(75.0% vs. 67.1%)及优质囊胚率(47.2% vs. 44.5%)均略高于原核消失较晚的胚胎，但差异无统计学意义(P>0.05)。我们的研究结果与之一致，如表2中数据显示：0PN来源胚胎的囊胚形成率和可利用囊胚率均显著高于2PN来源胚胎(P<0.05)，其优质囊胚率略高于2PN来源胚胎，但差异无统计学意义(P>0.05)。

胚胎基因组激活开始于4～8细胞时期，经过3 d的体外培养，胚胎逐渐表达自身基因[17]。卵裂期胚胎发育并形成囊胚，表明胚胎基因组已经激活，能够发育至囊胚的胚胎其染色体异常率较低，因此可以通过延长体外培养时间来筛选出异常受精的0PN来源胚胎[18]。我们临床常规策略是将0PN来源胚胎进行囊胚培养，若形成可利用囊胚则冷冻保存，在患者无2PN来源囊胚可移植的情况下，移植0PN来源囊胚以增加妊娠机会。Wang等[19]研究发现，源自于正常受精的0PN来源胚胎，其囊胚形成率较高；而源自于异常受精的0PN来源胚胎，其囊胚形成率很低。基于以上结论和我们的结果推测，部分0PN来源胚胎很有可能来自于2PN受精卵。因此，我们对这些0PN来源囊胚进行了染色体检测并与临床同一时期的PGT-M周期中2PN来源囊胚进行比较，结果表明，IVF-0PN来源囊胚的染色体整倍体率略高于PGT-M-2PN来源囊胚，但差异无统计学意义(76.2% vs.75.7%，P>0.05)，这证实了大部分0PN来源胚胎的起源不是异常受精，而是没有观察到原核的正常受精卵。

0PN来源胚胎的临床应用仍然是一个有争议的话题。Chen等[6]研究认为，考虑到0PN为异常受精，所以0PN来源胚胎移植应该尽可能地结合植入前遗传学检测。同样，我们的结果显示，0PN来源囊胚存在23.8%(10/42)的染色体非整倍体率。因此，在胚胎移植前对0PN来源胚胎进行遗传学检测是很有必要的，可以确保移植染色体正常的0PN来源胚胎，以避免不良妊娠结局。本研究的一个优点是对所有纳入研究的0PN来源囊胚进行植入前遗传学检测，获得了明确的染色体整倍体结果，能够为这些胚胎的后期临床应用提供准确的遗传学支持。但我们的研究也有一定的局限性：首先，纳入的0PN来源囊胚数量较少；其次，由于入组患者均未进行0PN来源囊胚移植，所以无法随访临床妊娠及新生儿出生结局。

综上，在本研究中，使用固定时间原核评估方法获得的0PN来源胚胎，其发育速度及发育潜能优于2PN来源胚胎，并且0PN来源囊胚的染色体整倍体率也略高于同期PGT-M-2PN来源囊胚。提示大部分0PN来源胚胎可能源自于正常受精卵，因而在常规IVF中，对于固定时间原核评估为0PN的胚胎来说，直接丢弃非明智之举，其临床应用价值需要结合植入前遗传学检测进行重新评估和加以重视。