华通胶间充质干细胞移植改善大鼠肺动脉高压的疗效观察

王 力，宗刚军，陈 亮，王圩健

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是一大类以肺动脉压力进行性增高，伴有肺小动脉内皮功能障碍、血管重塑为特征的疾病，往往可引起右心功能衰竭甚至死亡[1]。目前常用于PAH的药物有钙离子拮抗剂、前列环素、内皮素-1受体拮抗剂、磷酸二酯酶5型抑制剂等[2]。尽管这些药物确实延缓了疾病进程，但由于该病的病因并不完全清楚，因此目前尚没有能治愈该疾病的方法，多数患者都会走向心肺功能衰竭的结局。诸多的动物实验均证实了同种属或异种属间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）治疗PAH的可行性与有效性[3-5]。

本课题组前期从人脐带结缔组织中分离出黏液样物质Wharton’s jelly并从中培养出大量MSCs，称为华通胶间充质干细胞（wharton’s jelly derivedmesenchymal stem cells,WJ-MSCs），具有分化潜力大、增殖能力强、无免疫源性、无致瘤性、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征[6]。目前，MSCs的体外培养主要是以含胎牛血清的基础培养基为主，含有异源性蛋白，易引起人体的过敏反应，阻碍了MSCs在临床的应用与推广。无血清培养基（serum-ree media,SFM）是一种合成培养基，主要由基础培养基和补充因子组成，可以避免血清源性污染及血清成份对实验研究的影响。本研究采用WJ-MSCs作为种子细胞，在无血清培养条件下体外扩增后移植PAH大鼠模型，探索WJ-MSCs对PAH大鼠模型的治疗作用，为PAH患者的干细胞临床试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞该实验所用6周龄雄性SD大鼠（SPF级，体质量200～220 g）购自杭州医学院实验动物中心（生产许可证号SCXK浙2019-0002），饲养于联勤保障部队第904医院SPF级动物房。饲养环境为恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，每天照明12 h，自由饮水进食。本实验所用脐带来源于联勤保障部队第904医院妇产科2021年10月40周胎龄剖宫产胎儿，经联勤保障部队第904医院实验动物伦理委员会批准（编号：20220909），同时经产妇及其家属同意，产妇健康，无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。

1.2 干细胞培养及表型鉴定无菌取剖宫产新鲜脐带，以平衡盐溶液洗去脐带残留血液，剔除脐带动静脉，取结缔组织中的胶状物（此胶状物即为华通胶Wharton’s jelly）并剪切成1 mm3及以下小块，分装接种于数个75 cm2培养瓶中，每瓶加入10 mL间充质干细胞SFM（北京友康生物，货号NC0103），置于37℃、饱和湿度的细胞(含5%CO2)培养箱中培养，每2～3 d半量换液1次，每日观察组织块周围，待细胞贴壁融合至80%以上时传代培养，传代培养至P3代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标志物。弃培养基，用干细胞温和消化酶（北京友康生物，货号NC1004）消化，SFM终止消化后离心、重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/mL单细胞悬液1 mL/管，共6管，分别加入小鼠抗人单克隆抗体FITCCD34、FITC-CD45、PE-CD44、PE-CD73、PE-CD90、PE-CD105各20 μL，充分混匀，避光室温孵育30 min，平衡盐缓冲液洗2遍后离心（1000 r/min,5 min,离心半径10 cm），重悬成0.5 mL/管进行流式细胞仪表型检测。

1.3 PAH大鼠模型建立及实验分组将30只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（control组）、模型组（MCT组）、WJ-MSCs移植组（MCT+WJMSC组），每组10只大鼠，三组同等条件饲养。将模型组、WJMSCs移植组大鼠一次性腹腔注射野百合碱（60 mg/kg）（Sigma Aldrich，货号C2401），对照组腹腔注射等量生理盐水。饲养14 d后从WJ-MSCs移植组大鼠尾静脉注射0.5 mL细胞悬液（含2×106WJMSCs），对照组和模型组大鼠尾静脉注射0.5 mL生理盐水，处理后于同等条件下继续饲养21 d，每周称量大鼠体质量并记录。

1.4 右心室收缩压及右心肥大指数检测野百合碱注射后第35天，各组大鼠称重后腹腔内注射戊巴比妥钠（按体质量40 mg/kg）麻醉，然后固定于大鼠操作台。右侧颈部行纵形切口，钝性分离右颈外静脉，远心端结扎，近心端剪开颈外静脉，将预充盈肝素钠盐水的聚乙烯PE50导管缓缓插入，经上腔静脉入右心房后进入右心室，尾端连接三通管，通过换能器连接MP150生物信号采集系统（美国BIOPAC公司），记录各组大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）。脱臼法处死各组大鼠并取出心脏，剪除心房，沿室间沟分离右心室（RV）及左心室加室间隔（LV+S），滤纸吸水后分别称重，以RV/（LV+S）得出各组大鼠右心肥大指数（right ventricle hypertrophy index,RVHI），反映右心室的质量变化。

1.5 病理学检测取各组大鼠左肺组织块常规石蜡包埋、组织切片并行HE染色，在倒置相差显微镜下观察肺小动脉的病理改变，每组随机选取与终末细支气管伴行的管径50～100 μm肺小动脉10根，运用图像分析软件测量肺小动脉管壁相对中膜厚度（medial thickness,MT）、外径（external diameter,ED）、中膜面积（membrane area,MA）及血管总面积(total arterial area,TAA)；分别计算中膜厚度占血管外径百分比（2MT/ED×100%)、管腔狭窄率（MA/TAA×100%)。

1.6 统计学处理采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，单个时间点的多组数据间比较，若符合正态分布且方差齐性采用单因素方差分析，多重比较采用LSD或Tukey法检验。重复测量资料的多组数据间比较采用单变量方差分析，两两比较采用LSD-t法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WJ-MSCs的培养及鉴定结果原代WJ-MSCs培养约8～10 d后，组织块间隙可见大量细胞贴壁生长，形态不均一，以短梭形、三角形为主，呈平行紧密排列或漩涡状生长，连续传代培养的5代细胞增殖趋势相对稳定，细胞形态逐渐均一，呈纺锤形（图1）。流式细胞仪检测P3代细胞表型，结果显示实 验 培 养 的WJ-MSCs表 达CD44、CD73、CD90、CD105，而不表达CD45、CD34（图2），符合间充质干细胞的表型特点。

图1 光镜下原代（A，×100）及P3代（B，×200）WJ-MSCs形态

图2 P3代WJ-MSCs流式细胞仪检测表型

2.2 动物一般情况及生存质量观察与对照组大鼠比较，模型组、WJ-MSCs移植组大鼠在注射野百合碱第10天后，活动明显减少，饮食、水量减少，呼吸较急促，体重增长速度减缓（图3）。模型组在注射野百合碱第18天后开始出现死亡，注射后第21天时死亡率为30%，注射后第35天死亡率为50%。WJ-MSCs移植组在移植干细胞1周后食欲逐渐恢复，体重渐增加，活动良好，在实验结束时，对照组及WJ-MSCs移植组大鼠生存率100%。与对照组相比，其余两组大鼠注射野百合碱第14天后体重均有显著下降（F=36.97,P<0.01），其中模型组下降最为明显。

图3 实验期间各组大鼠体重变化

2.3 右心室收缩压及右心肥大指数注射野百合碱5周后，与对照组大鼠RVSP（23.5±1.09 mmHg）比较，模型组大鼠（47.8±1.3 mmHg）、WJ-MSCs移植组（41.5±1.72 mmHg）大鼠RVSP明显升高（F=642,P<0.01）,提示肺动脉高压模型造模成功（图4A）。WJ-MSCs移植组与模型组相比RVSP明显降低（P<0.01）。从RVHI结果来看，模型组（0.383±0.03）及WJ-MSCs移植组（0.348±0.03）较对照组（0.287±0.02）大鼠右心肥厚程度显著增加（F=31.46,P<0.01），但WJMSCs移植组较模型组大鼠右心肥厚程度有所下降（P<0.05）（图4B）。

图4 各组大鼠RVSP及RVHIA：右心室收缩压,B：右心肥大指数；*P<0.05,**P<0.01

2.4 病理形态观察及图像分析结果对照组大鼠肺小动脉内皮连续性好，炎性细胞较少，管壁均一（图5A）。模型组大鼠肺小动脉管壁向心性增厚，中膜平滑肌细胞明显增生伴炎性细胞浸润，致管腔明显狭窄（图5B）。WJ-MSCs移植组大鼠肺小动脉中膜增生程度介于对照组与模型组之间，管腔轻中度狭窄（图5C）。三组大鼠中膜厚度占血管外径百分比（F=146.8,P<0.01）、管腔狭窄率（F=138,P<0.01）均有显著差异，模型组最高，WJ-MSCs移植组次之，两组数值明显高于正常对照组（P<0.01），同时WJMSCs移植组中膜厚度占血管外径百分比、管腔狭窄率明显低于模型组（P<0.01）（图6A、6B）。

图5 各组大鼠肺小动脉显微结构改变（H-E染色，×200）

图6 各组大鼠肺小动脉中膜厚度占血管外径百分比及管腔狭窄率比较A：中膜厚度占血管外径百分比，B：管腔狭窄率；**P<0.01

3 讨论

Bourgeois等[7]在研究PAH的病理生理学机制过程中提出了细胞增殖和退化假说，内皮损伤和功能障碍参与抑制肺动脉高压模型中的细胞凋亡，促进肺小动脉闭塞性丛集病变的形成，而细胞损伤可引起内皮功能障碍，进而引起肺小动脉功能障碍。再生细胞治疗旨在修复内皮损伤和功能障碍，同时恢复肺小动脉功能。目前常见的干细胞治疗种子细胞有内皮祖细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞等[8]。MSCs属于多能成体干细胞，其来源于中胚层间充质，分布于骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等，其自我更新及分化潜能不如胚胎干细胞，但较内皮祖细胞强，有向骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等分化的能力[9]。本研究中采用的WJ-MSCs取材于废弃的人体脐带组织，避免了胚胎干细胞面临的医学伦理问题，它介于胚胎与成体组织之间，具有类似胚胎干细胞的原始特性，其强大的再生潜能在组织修复和血管生成中起着重要作用，经过体内注射后可迁移到损伤部位，分化并促进修复[10-11]。此外，WJ-MSCs具有独特的免疫学特性，表达人类白细胞Ⅰ类抗原（human leukocyte antigen-1,HLA-Ⅰ）、HLA-G，不表达HLA-DR，从而避免自然杀伤细胞的免疫排斥及T淋巴细胞活化，表现为低免疫源性[12]。如果能在体外提取、培养及传代过程中避免接触异源性蛋白，WJ-MSCs将有望成为最具应用前景的临床应用级别的间充质干细胞。因此，本研究选择无血清培养体系对WJ-MSCs进行体外培养，避免常规培养体系中不同程度的异种蛋白混入，避免因异种蛋白造成的移植宿主对移植干细胞的排斥反应。

许多动物实验研究发现，MSCs显示出较低的组织持久性和植入率，约5%[13]。移植的MSCs在受体组织中的低存活率可能与培养条件或在受体内环境有关，因此对其使用有很大的限制[14]。然而，越来越多的证据表明，MSCs修复和改善受损组织功能的能力并不一定需要显著的植入或分化率[11]。事实上，间充质干细胞的旁分泌机制实现了与靶细胞之间的细胞通讯与联系[15]。MSCs分泌的生物活性因子介导MSCs的免疫调节、抗炎、抗氧化、抗凋亡等功能。它们还有助于组织再生、血管生成和微生物的清除。本研究中首次采用无血清培养体系培养WJ-MSCs用于移植PAH大鼠模型，发现移植后大鼠生存率明显改善，右心室动脉压较模型组下降，右心肥厚程度下降，提示WJ-MSCs移植后可有效缓解PAH所产生的肺小动脉压力升高、右心压力负荷重的病理生理过程。从病理结构上看，WJMSCs移植后从一定程度上逆转了PAH大鼠肺小动脉中膜过度增生及血管周围炎性细胞浸润的病理改变，从而缓解了肺动脉压力进行性升高的进展过程。该研究结果产生的机制有如下可能：（1）诸多研究发现，野百合碱诱导的PAH动物模型，主要通过损伤肺动脉内皮细胞，导致内皮细胞坏死、脱落，进而整个肺动脉血管发生纤维化、硬化[16]，小动脉周围巨噬细胞浸润，白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子水平升高，病理结果显示WJ-MSCs移植进入受体后小动脉周围炎性细胞浸润程度较模型组减轻，可能通过旁分泌机制产生生物活性因子，一定程度上起到免疫调节、抗炎作用[17,18]。（2）Zhang等[19]发现，野百合碱诱导的PAH大鼠经舌下静脉注射大鼠骨髓MSCs后，肺动静脉壁面积较PAH大鼠模型组显著增加，通过荧光染色发现，血管内皮生长因子(VEGF)及血管性假血友病因子(vwF)抗体在移植区显著增加，提示MSCs移植后能在肺内分化成血管内皮细胞。本实验中WJ-MSCs移植后可能受内环境影响分化成血管内皮细胞，修复受损的肺动脉血管内皮。（3）WJ-MSCs通过旁分泌机制分泌促血管生成物质，刺激新生血管网及侧枝循环形成，缓解肺小动脉压力过高，改善肺内血流及氧供平衡[20]。

另一方面，WJ-MSCs移植PAH大鼠后虽然在血流动力学及病理结构方面较模型组有所改善，但仍无法完全逆转肺小动脉中膜增生过程，分析原因主要包括：（1）移植细胞量不足或移植途径引起的移植效率不足。考虑到动物模型的总体循环血量有限，无法一次性输注过多的细胞悬液。另外，经尾静脉注射的干细胞需经下腔静脉循环，部分细胞无法到达靶病变处。有文献报道，除尾静脉注射外，经舌下静脉、颈外静脉以及气管内注射干细胞，均可实现本研究类似结果[19,21,22]，但各种移植途径的优劣尚缺乏系统比较。（2）旁分泌产生的生物活性因子数量有限，可能无法完全抑制炎症反应的进展。因此，采用基因修饰的方法将生物活性因子基因转染干细胞，进而在移植供体内持续高表达，进而发挥持久的抗炎作用是可能的解决途径。（3）肺动脉高压病理生理机制复杂多样，单一的机制补偿不足以逆转疾病转归。在今后的研究中，我们将采用基因修饰的WJ-MSCs移植治疗PAH，并对比多种移植途径的移植效率，探索更加优化的干细胞移植方案。