miR-138-5p在结直肠癌中的表达及其生物学功能*

张艳，吴昊，石丽洪，畅靖嘉，朱剑军

471000河南 洛阳，郑州大学附属洛阳中心医院/洛阳市中心医院 病理科（张艳）；030001 太原，山西医科大学 基础医学院（吴昊、石丽洪、畅靖嘉、朱剑军）

结直肠癌是一种常见的消化系统肿瘤，其发病率和病死率分别位居所有恶性肿瘤第三位和第二 位［1］。结直肠癌的发生进展是一个多基因参与、多步骤的恶性癌变过程［2］。近年来，越来越多的文献报道微小RNAs（mircroRNAs，miRNAs）与恶性肿瘤的发生与进展密切相关［3］。miRNA是一类最小的非编码RNA，由约23个核苷酸组成［4］。miRNA通过与其靶基因mRNA的3'非翻译区（3' untranslated region，3'UTR）结合，调控靶基因转录表达［5］。截止目前，已发现约60%编码基因受miRNAs调控［3］。来自全球不同类型恶性肿瘤患者 miRNA表达谱数据结果显示，miR-138是一个典型的肿瘤抑癌因子［3］。作为一个抑癌因子，miR-138通过直接结合癌基因的mRNA序列，抑制癌蛋白表达［3］。有研究报道miR-138在多种恶性肿瘤中表达水平均呈显著下调，如肝细胞癌、胃癌、乳腺癌、肾癌等［3，6-7］。例如，miR-138在约70%肝细胞癌患者癌组织中呈低表达，其通过靶向结合SOX9或细胞周期素D3抑制肝癌细胞增殖和侵袭［7］。但是，在小胶质瘤肿瘤干细胞亚群中miR-138呈高表达，发挥促癌功能［8］。截至目前，研究者们尚未完全确定miR-138-5p在结直肠癌生长过程中的功能作用。本研究利用公共数据库分析miR-138-5p在结直肠癌中的表达水平，分别采用miRNA mimics和inhibitors升高或降低miR-138-5p表达水平，CCK-8和EdU检测结直肠癌细胞生长和增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡，PCR结合公共数据预测miR-138-5p靶基因，明确miR-138-5p在结直肠癌细胞恶性生长过程中的功能作用，初步探讨相关作用机制，从而为阐明结直肠癌的发病机制提供理论基础，为结直肠癌诊疗提供潜在作用靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM高糖培养液、胎牛血清（Hyclone公司，美国），CCK-8（碧云天公司，中国），EdU细胞增殖检测试剂盒（锐博公司，中国），Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒（贝博，中国），Lipofectamine 2000、TRIzol Reagent （Invitrogen，美国），PrimeScriptTM第一条链cDNA合成试剂盒、TB Green qPCR Premix（Takara公司，日本），miRNA第一链cDNA合成试剂盒（生工，中国）。

1.2 公共数据获取

下载癌症基因组数据库（The Cancer Genome At- las，TCGA）中结肠癌转录组数据和临床信息数据。通过limma包筛选差异表达基因。筛选差异表达基因的条件为：|logFC| ＞ 1，P＜0.01，且具有完整的临床信息及随访信息。GEO官网搜索GSE73487，下载结肠癌数据集。

1.3 细胞培养和转染

常规培养结直肠癌Ls174T细胞。用含10%胎血清的DMEM高糖培养液于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。将细胞接种于6孔板，24 h后，待细胞生长至对数生长期时，进行细胞转染，操作步骤参照脂质体说明书进行。本研究共分4组：mimic对照组、miR-138 mimic组、inhibitor对照组、和miR-138 inhibitor组。miR-138 mimic序列（sense 5'-3'：AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCCG；Antisense 5'- 3'：GCCUGAUUCACAACACCAGCUUU）；miR-138 inhibitor序列（5'-3'：CGGCCUGAUUCACAACACCA- GCU）；以上序列由通用生物公司合成。

1.4 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）

提取RNA，按照miRNA第一链cDNA合成试剂盒步骤合成cDNA，用于后续miRNA表达水平检测；按照PrimeScriptTM第一条链cDNA合成试剂盒步骤合成cDNA后，用于后续mRNA表达水平检测。采用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。miR-138-5p上游引物序列（5＇-3＇：AGCTGGTGTTGTAATCAGGCC），下游引物为通用PCR引物，U6为内参照。NEBL、SOX4、EZH2和SOX12引物序列见表1，β-actin为内参照，以上序列由生工合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1．Primer Sequences for qRT-PCR

1.5 CCK-8实验

常规接种细胞于6孔板。细胞转染6 h后将细胞接种于96孔细胞培养板，待细胞贴壁后记为0 h。分别在0 h、24 h、48 h、72 h这4个时间点检测细胞活力。CCK-8溶液孵育1 h后，于酶标仪450 nm处检测。

1.6 EdU实验

常规接种细胞于24孔板。细胞转染24 h后进行EdU细胞增殖检测实验。加入适量EdU工作液，孵育2 h。后续经多聚甲醛固定、PBS溶液冲洗、EdU反应、Hoechst染色等步骤完成实验，用倒置荧光显微镜拍照。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡

常规接种细胞于6孔板。细胞转染48 h后进行细胞凋亡检测实验。收集细胞，预冷PBS冲洗3次，结合缓冲液重悬、加入Annexin-V避光染色10 min，加入PI避光染色10 min，上机检测。在转染inhibitor的对照组和实验组细胞中，使用的凋亡诱导剂为5-FU（25μmol/L）。

1.8 生物信息学预测miR-138-5p靶基因

利 用TargetScan、miRDB、RNA22和picTar等4 个网站预测，预测miR-138-5p靶基因。通过Venny 2.1获取上述靶基因的交集。

1.9 统计学方法

所有数据使用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验，采用Pearson 相关系数进行相关性分析，P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-138-5p在结直肠癌组织中呈低表达

本研究利用结直肠癌GSE73487数据，分析miR-138-5p在90例结直肠癌组织中的表达水平。结果表明，与正常结直肠组织相比，miR-138-5p在结直肠癌组织中表达水平显著降低［（2.182 ± 0.068） vs （2.053 ± 0.024），P ＜ 0.05；图1］。

图1 miR-138-5p在结直肠癌中的表达水平Figure 1．Expression of MiR-138-5p in Colorectal Carcinoma

2.2 验证miR-138-5p mimic和miR-138-5p inhibitor效果

为了检测 miR-138-5p mimic和inhibitor升高或降低 miR-138-5p的效果，本研究采用qRT-PCR检测 miR-138-5p 表达水平，结果显示，与mimic对照组相比，miR-138-5p mimic组miR-138-5p表达水平显著升高，升高倍数为36.6 ± 0.40（P ＜ 0.01；图2A）。与inhibitor对照组相比，miR-138-5p inhibitor组miR-138-5p表达水平显著降低，降低85.50% ± 0.32%（P ＜ 0.01；图2B）。以上研究结果表明，miR-138-5p mimic和inhibitor能够有效升高或降低miR-138-5p水平。

图2 转染 miR-138-5p mimic和miR-138-5p inhibitor后miR-138-5p在结直肠癌细胞中的表达Figure 2．Expression of MiR-138-5p in Colorectal Carcinoma Cells after Transfecting with MiR-138-5p Mimic or MiR-138-5p Inhibitor

2.3 miR-138-5p对结直肠癌细胞生长的影响

为了研究miR-138-5p表达水平对结直肠癌细胞活力的影响，本研究采用CCK-8检测细胞活力。结果显示：与mimic对照组相比，miR-138-5p mimic能够显著抑制细胞生长（P ＜ 0.01；图3A）；与inhibitor对照组相比，miR-138-5p inhibitor能够显著促进细胞生长（P ＜ 0.01；图3B）。为进一步验证miR-138-5p对结直肠癌细胞增殖活性的影响，本研究采用EdU检测细胞增殖活性。结果表明：mimic对照组细胞增殖率为24.33% ± 0.64%，miR-138-5p mimic组细胞增殖率为18.90% ± 0.26%，其差异具有统计学意义（P ＜ 0.01；图4A）。inhibitor对照组细胞增殖率为24.83% ± 0.84%，miR-138-5p inhibitor组细胞增殖率为35.13% ± 0.35%，其差异具有统计学意义（P ＜ 0.01；图4B）。以上结果表明，miR-138-5p表达水平与结直肠癌细胞生长密切相关。

图3 miR-138-5p对结直肠癌细胞活力的影响Figure 3．Effects of MiR-138-5p on the Viability of Colorectal Carcinoma Cells

图4 miR-138-5p对结直肠癌细胞增殖的影响Figure 4．Effects of MiR-138-5p on the Proliferation of Colorectal Carcinoma Cells

2.4 miR-138-5p对结直肠癌细胞凋亡的影响

为研究miR-138-5p对结直肠癌细胞凋亡的影响，本研究通过流式细胞术检测miR-138-5p表达水平改变对结直肠癌细胞凋亡的影响。结果显示：mimic对照组细胞凋亡率为4.90% ± 0.13%，miR-138-5p mimic组细胞凋亡率为25.60% ± 1.21%，其差异具有统计学意义（P ＜ 0.01；图5A）。在Ls174T细胞中，转染inhibitor 对照或miR-138-5p inhibitor 24 h后，加入5-FU（25 μmol/L）作用24 h，上机检测细胞凋亡情况。结果发现，inhibitor对照组细胞凋亡率为28.95% ± 0.95%，miR-138-5p inhibitor组细胞凋亡率为14.36% ± 0.54%，其差异具有统计学意义（P ＜ 0.01；图5B）。以上结果表明，miR-138-5p表达水平与结直肠癌细胞凋亡有关。

图5 miR-138-5p对结直肠癌细胞凋亡的影响Figure 5. Effects of MiR-138-5p on the Apoptosis of Colorectal Carcinoma Cells

2.5 筛选miR-138-5p下游靶基因

通 过TargetScan、miRDB、RNA22和picTar等4 个网站预测，筛选得到65个miR-138-5p靶基因（图6A）。课题组前期通过利用TCGA公共数据库，筛选获得2 954个在结直肠癌中呈差异表达的基因，与miR-138-5p下游靶基因取交集后，共筛选得到16个在结直肠癌中呈差异表达的miR-138-5p靶基因（图6B），具体信息见表2。根据miRNAs与靶基因相互作用原理，本研究重点关注在结直肠癌中呈显著高表达的靶基因，即星云状小体（nebulette，NEBL）、SRY盒 转 录 因 子4（SRY-box transcription factor 4，SOX4）、zeste2多梳抑制复合体2亚基增强子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和SRY盒 转 录 因 子12（SRY-box transcription factor 12，SOX12）。结果显示，与正常结直肠组织相比，NEBL、SOX4、EZH2和SOX12在结直肠癌组织中表达水平均显著升高（6.446± 0.042 vs 4.210±0.096；7.244±0.034 vs 5.702 ±0.078；5.191±0.026 vs 3.935±0.084；4.539± 0.045 vs 3.444±0.092；均P ＜ 0.01）（图7A）。相关性结果显示：miR-138-5p与NEBL呈显著负相关（r = - 0.166，P ＜ 0.01），miR-138-5p与EZH2呈显著负相关（r = - 0.162，P ＜ 0.01）；miR-138-5p与SOX4和SOX12相关性无统计学意义（P = 0.06；P = 0.32）（图7B）。

图7 miR-138-5p靶基因的表达水平及相关性分析 Figure 7．Expression of Targets Genes of MiR-138-5 and Its Correlation Analysis

表2 结直肠癌中miR-138-5p靶基因的表达水平 Table 2．Expression of Targets Genes of MiR-138-5p in Colorectal Carcinoma

图6 筛选miR-138-5p靶基因 Figure 6. Screening of Target Genes of MiR-138-5p

2.6 miR-138-5p靶向调控NEBL和EZH2

为进一步验证miR-138-5对靶基因的调控作用，本研究通过qRT-PCR验证靶基因表达水平是否随miR-138-5表达水平改变而改变。结果显示，在Ls174T细胞中，与mimic对照组相比，miR-138-5p mimic组NEBL和EZH2表达水平显著降低，降低率分别为62.00% ± 0.60%、57.50%±0.65%，其差异均具有统计学意义（均P ＜ 0.05；图8A）。与inhibitor对 照 组 相 比，miR-138-5p inhibitor组NEBL和EZH2表达水平升高，升高倍数分别为3.10±0.22、2.21±0.22，差异均具有统计学意义（均P ＜ 0.05；图8B）。上述研究结果表明，NEBL和EZH2可能是miR-138-5p的下游靶基因。

图8 miR-138-5p调控NEBL和EZH2表达水平 Figure 8. MiR-138-5p Regulates the Expression of NEBL and EZH2

3 讨 论

结直肠癌是一种常见的消化系统肿瘤，2020年全球新增结直肠癌190万余例，新增死亡93万余例，其发病率和死亡率分别居所有恶性肿瘤第三位和第二位［1］。miRNAs通过靶向调控目的基因促进肿瘤发生进展［3］。已有研究证实，miR-138-5p在胃癌、卵巢癌、食管鳞癌、胰腺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中呈低表达。例如，miR-138在胃癌组织和胃癌细胞系中呈低表达，且miR-138表达水平与TNM分期和淋巴结转移等相关［6］。Ding等［9］报道，miR-138-5p在卵巢癌中呈低表达。在食管鳞状细胞癌患者癌组织和血浆中均发现miR-138水平显著降低，且miR-138表达水平与T分期、淋巴结转移和TNM分期等临床病理特征有关［10］。低表达miR-138食管鳞癌患者5年总生存期显著缩短，高度提示miR-138表达水平降低是食管鳞癌一个独立预后危险因素［10］。miR-138-5p在胰腺癌中表达水平显著降低［11］。已有研究报道，miR-138-5p 在结直肠癌中表达水平降低［12-14］。miR-138表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期有关［13］。与低表达miR-138组患者相比，高表达miR-138组结直肠癌患者生存期显著延 长［13］。与上述研究结果一致，本研究发现miR-138-5p在结直肠癌中表达水平显著降低，提示miR-138可能参与结直肠癌发生与进展。

miR-138参与调控肿瘤细胞生长、凋亡、迁移、侵袭和血管形成等生物学过程。例如，过表达miR-138后，胃癌细胞增殖活性、克隆形成能力，迁移和侵袭活性均显著降低。体内实验进一步证实过表达miR-138抑制肿瘤生长［6］。在卵巢癌中发现，抑制miR-138能够显著促进卵巢癌细胞生长、克隆形成能力、和迁移［9］。过表达miR-138能够显著抑制肾癌细胞增殖和迁移［15］。Xu等［16］研究结果也表明，过表达miR-138抑制结直肠癌细胞增殖和转移。miR-138-5p抑制结直肠癌细胞迁移，负向调控结直肠癌细胞化疗耐药性［12］。本研究发现，miR-138-5p抑制结直肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡，最终抑制结直肠癌细胞生长；抑制miR-138-5p能够显著促进结直肠癌细胞生长。此外，抑制miR-138-5p能够显著抑制结直肠癌化疗药物5-FU诱导的细胞凋亡，提示miR-138-5p下调可能是结直肠癌化疗耐药的潜在影响因素。

与其他miRNA类似，miR-138-5p亦通过与靶基因结合，导致靶基因降解，参与恶性肿瘤细胞发生与进展。Wang等［6］报道，miR-138通过靶向调控表皮生长因子受体表达水平，抑制胃癌细胞增殖和迁移。有文献报道，转录因子NFIB是miR-138-5p的靶基因，miR-138-5p通过特异性靶向结合NFIB，调节Snail转录表达，调控结直肠癌细胞迁移［12］。在结直肠癌细胞中，PODXL是miR-138的靶基因，过表达PODXL能够显著逆转miR-138介导的抑癌作 用［16］。本研究通过利用TargetScan、miRDB、RNA22和picTar等4个网站，结合课题组前期筛选的结直肠癌差异表达基因和实验验证，预测NEBL和EZH2可能是miR-138-5p的下游靶基因，但这一结论有待进一步实验证实。

综上所述，miR-138-5p在结直肠癌中呈低表达。过表达miR-138-5p后，结直肠癌细胞增殖活性减弱，细胞凋亡增多；抑制miR-138-5p后，结直肠癌细胞增殖活性增强。机制研究表明，miR-138-5p可能通过靶向NEBL和EZH2，调控结直肠癌恶性生长。但是miR-138-5p是否特异性靶向调控NEBL和EZH2，NEBL和EZH2等信号分子在miR-138-5p介导的结直肠癌细胞生长过程中发挥怎样的作用，这些问题有待进一步探讨。

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