抗肺炎克雷伯氏菌的北冰洋来源菌株的筛选与鉴定

石悦炜，徐麓凯，李相达，陈 怡，郑 立，金黎明

(1.大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116605；2. 自然资源部第一海洋研究所自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室，山东 青岛 266061)

肺炎克雷伯氏菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属的一种革兰氏阴性杆菌，自然存在于健康人体中，大多呈大叶分散，一般出现在肺上叶(右上叶多)，在临床中该菌是第二大条件致病菌。具有健康免疫系统的人很少会发生该菌引起的疾病感染，但在免疫力受损、防御功能缺陷或者接受有创伤性治疗的情况时会引发肺炎等炎症疾病[1]。肺炎克雷伯氏菌的宿主范围较广，不仅能引起包括人类和灵长类的动物感染肺内出血、脓气胸、心包炎等疾病，还能引起植物疾病，如玉米顶腐病、香蕉叶斑病、高粱叶斑病和石榴枯萎病等[2]。近年来，因为抗生素在临床感染疾病中的大规模应用和不规范使用，部分正常菌群、条件致病菌正慢慢取代传统致病菌而变成主要病原菌[3]。肺炎克雷伯氏菌是社区获得性感染的首要致病菌之一，它会致使呼吸道、消化道和泌尿系统产生感染，在新生儿病房、泌尿科病房等病房突发盛行[4]。肺炎克雷伯氏菌对抗生素耐药的情况越来越不乐观，特别是对碳青霉烯类的耐药性十分严重，也造成了临床治疗上的难题。因此，寻找高效、低毒、安全、稳定的抗肺炎克雷伯氏菌药物迫在眉睫，对于控制感染流行和临床治疗有着重要的意义[5]。

海洋具有独特的气候及地理特征，如高压、寡营养、无光照、局部高温等，生存于其中的海洋微生物为了能适应这些环境，必须以不同于陆生微生物的生存策略以求生存，从而形成了特殊的微生物生态系统。因此海洋微生物也被赋予了独特的生物学特性，使其可能产生不同于陆生微生物的结构新颖、性质独特的代谢产物，为新药及新抗生素的开发奠定了基础。海洋成为了人类重要的微生物资源宝库[6-8]，也使其孕育了独特的微生物类群，为科研工作者研究微生物抗菌活性物质提供条件，具有明显的优势和特点。广阔的海洋如同包揽星辰的宇宙，是生命的发源地也是生命的摇篮[9]，而海洋微生物资源的拓展和生物活性的发现已然成为人们研究的热点领域之一，海洋特殊的生长环境增加了发现新型活性次级代谢产物的可能性，展现出巨大的应用潜力[10-12]。

本研究以生物抗菌活性为导向，从北冰洋海泥样品中分离纯化并筛选出能够抑制肺炎克雷伯氏菌生长的菌株，采用形态观察、生理生化实验及16S rDNA基因序列分析对其进行菌种鉴定，并对其抑菌广谱性进行研究，为后期从中探索得到高效力抗菌活性物研究奠定基础，并进一步对其抗菌活性物质进行研究，应用前景广阔。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样 品

样品为自然资源部第一海洋研究所提供的南极科学考察得到的北冰洋海泥样品。

1.1.2 菌 株

白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC 52201、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、大肠杆菌(Escherichiacoli)CMCC 44102、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticu)CGMCC 1.1616、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CICC 21484、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)BNCC 194496、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)BNCC 336951、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)BNCC 186113，本实验室保藏。

1.1.3 培养基

营养肉汤(nutrient broth，NB)培养基：牛肉粉3 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、去离子水1.0 L。

营养琼脂(Nutrient Agar Medium，NA)培养基：牛肉粉3 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、去离子水1.0 L。

LB(Luria Broth)海水培养基：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、海水1.0 L。

LA(Luria Agar)海水培养基：胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、琼脂20 g，海水1.0 L。

葡萄糖培养基：蛋白胨2.7 g、氯化钠5 g、磷酸氢二钠0.3 g、1%的溴麝香草酚兰水溶液3.0 ml、琼脂15.0 g、去离子水1.0 L。

通用培养基：蛋白胨2 g、葡萄糖10 g、酵母膏1 g、琼脂20 g、去离子水1.0 L。

明胶培养基：蛋白胨5 g、明胶120 g、牛肉浸膏3 g、去离子水1.0 L。

苯丙氨酸培养基：DL苯丙氨酸2 g(或L苯丙氨酸1 g)、氯化钠5 g、酵母浸膏3 g、琼脂12 g、磷酸氢二钠1 g、去离子水1.0 L。

MRS即用型培养基：MRS肉汤48.3 g、去离子水1.0 L。

BHI即用型培养基：BHI肉汤38.5 g、去离子水1.0 L。

以上培养基均在121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

BSA224S电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、 ZWY-A2102C双层恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)、HVE-50高压灭菌器(日本SANYO)、SW-CJ-2FD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、MJ-180B生化恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 海洋微生物的分离及纯化

菌株的分离采用稀释涂布平板法：取北冰洋海泥样品0.5 g于试管中，加入4.5 mL生理盐水，混匀，静置2 h，取10-6～10-2稀释浓度各100 μL，涂布平板。将上述接种完的培养皿，分别放在12 ℃和37 ℃的培养箱中，培养5～6 d后，再用接种针挑取形态不同的细菌单菌落，分别在12 ℃和37 ℃培养箱中培养5～6 d。

1.3.2 拮抗菌株的筛选

初筛：吸取100 μL肺炎克雷伯氏菌悬液接种到40 mL NA培养基中，混匀，倒入培养皿待凝固，将待测菌液采用平板划线法划线于培养基上。37 ℃条件培养12 h，查看划线的菌株区域旁是否出现明显透明的抑菌带。

复筛：采用琼脂扩散法[13]。吸取200 μL初筛显示抑菌活性的菌悬液接种到200 mL液体LB海水培养基中，37 ℃摇床培养(180 r·min-1)24 h，发酵液6 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min，取上清旋蒸浓缩100倍。12 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min，取上清打孔。将300 μL海洋微生物粗发酵液加入孔中，37 ℃条件培养12 h，测量抑菌圈的直径。重复上述步骤三次。

1.3.3 肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株的鉴定

(1)形态观察及生理生化试验。将筛选得到的肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株划线接种于LA海水培养基中，37 ℃条件培养12 h，观察其形态特点，再根据《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]对其生理生化特征进行鉴定，包括革兰氏染色、糖发酵试验、吲哚试验等。

(2)分子生物学鉴定。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)对PCR产物进行扩增。PCR扩增体系：模板7 μL、细菌通用引物27F和1492R各2 μL、2×Taq Plus Master Mix酶25 μL、双蒸水(dd H2O)14 μL，总体积为25 μL；PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min、98 ℃变性30 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸2 min，共30个循环，72 ℃再延伸5 min。

由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心的GenBank数据库中，进行同源性搜索比对，再采用MEGA 6.0软件中的邻接法绘制系统发育树[16]。

1.3.4 抑菌谱研究

采用琼脂扩散法研究菌株浓缩发酵液对各种致病菌的抑制效果[17]。鲍曼不动杆菌使用BHI培养基、肺炎克雷伯氏菌使用NB培养基、屎肠球菌使用MRS培养基，其他致病菌均使用LB培养基。

2 结果与分析

2.1 海洋微生物的分离纯化

从北冰洋海泥样品中共分离出114株海洋微生物。

2.2 肺炎克雷伯氏菌拮抗菌株的筛选

2.2.1 初筛结果

初筛出12株对肺炎克雷伯氏菌有明显抑制性的菌株如图1。

图1 初筛结果

2.2.2 复筛结果

采用琼脂扩散法进行复筛[18]，结果如图2，见表1。可见No.98发酵液抑菌效果最好，抑菌圈直径达(22.21±0.37)mm。

图2 12株菌株复筛结果菌谱图

表1 12株菌株复筛结果菌谱直径

2.3 No.98菌株的鉴定

2.3.1 形态观察

No.98菌株在LA海水培养基上形态如图3a。长出的菌落为乳白色，半透明凸起的圆形，易挑起，无褶皱，表面光滑呈乳状。革兰氏镜检结果为紫色如图3b，说明No.98菌株为革兰氏阳性菌。

a)菌落形态 b)革兰氏染色结果图3 No.98菌株的形态学特征

2.3.2 生理生化鉴定结果

No.98菌株的生理生化试验结果见表2。由结果可知，No.98菌株能分解葡萄糖产酸且不产气，能使明胶液化，能产生过氧化氢酶，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红试验均呈阴性。

表2 菌株No.98的生理生化特征

2.3.3 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建

基于16S rDNA基因序列构建No.98菌株的系统发育树，结果见图4。由图可知，该发育树为有根树，有唯一特殊结点及方向，各点由唯一途径产生不同结点。No.98菌株与其他芽孢杆菌属菌株聚于同一根，故可推断其为芽孢杆菌。因其与死谷芽胞杆菌(Bacillusvallismortis)聚于一支，亲缘关系最为相近，结合形态观察及生理生化特征，暂定No.98菌株为死谷芽胞杆菌(Bacillusvallismortis)。

图4 基于16S rDNA序列No.98菌株的系统发育树

2.4 No.98菌株的抑菌谱

抑菌谱测定结果如图5、见表3。根据初筛和复筛结果得出No.98菌株对肺炎克雷伯氏菌抑菌效果最好，对其他致病菌也有一定的拮抗作用。如，对作为革兰氏阳性致病菌的屎肠球菌有抑制作用，抑菌圈为(12.33±0.04)mm；对作为革兰氏阴性致病菌的鲍曼不动杆菌有抑制作用，抑菌圈为(14.13±0.83)mm。由此可以看出No.98菌株具有广谱抑菌性。但是No.98菌株对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、副溶血性弧菌没有抑制性。

表3 菌株No.98抑菌谱的测定结果

图5 No.98菌株抑菌谱图

3 结 论

本研究以肺炎克雷伯氏菌为指示菌，从北冰洋海泥中共分离出114株海洋微生物，其中12株对肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，抑菌效果最优的为No.98菌株，其抑菌圈直径达(22.21±0.37)mm。通过形态学观察、生理生化试验和分子生物学鉴定，确定其为死谷芽胞杆菌(Bacillusvallismortis)。通过抑菌谱实验得出该菌对鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌都具有一定的抑制作用，由此可以看出NO.98菌株具有较广的抑菌谱。

近年来，极地微生物的研究迎来热潮，由于其独特的理化特性、新鲜的次生代谢产物和丰富的基因资源，在医药、环保、工业以及食品等多个领域受到了广泛关注。在本研究中，北冰洋微生物特殊的生存环境，有可能产生结构新颖的活性物质。本实验筛选出NO.98菌株，后续将对其代谢物质的性质进行进一步的研究。