铁皮石斛叶干粉对蛋鸡盲肠菌群、短链脂肪酸、免疫性能和肠道屏障功能的影响

张浩馨，汪 涵,2，金航峰,2，何 珂,2，颜菲菲,2*，赵阿勇,2*

（1.浙江农林大学动物科技学院·动物医学院，浙江杭州 311300；2.浙江农林大学动物福利研究所，浙江杭州 311300）

动物肠道中存在一个数量庞大的菌群生态系统，肠道里的菌群和宿主动物相互作用，与宿主自身的营养物质的消化、代谢以及免疫功能密切相关[1-2]。肠道菌群与宿主的动态平衡对动物机体生命活动保持正常运转有着重要意义[3]，一旦这种平衡被打破，条件性肠道致病菌会趁虚而入，从而引起一系列肠道疾病。肠道微生物失调不仅会造成肠道疾病，还会造成免疫性和感染性疾病的发生[4]。铁皮石斛叶是草本中药铁皮石斛的副产物，与铁皮石斛茎类似，铁皮石斛叶主要由多糖、黄酮、生物碱等成分构成[5]，其多糖含量约为茎的三分之一[6]，黄酮含量高于茎[7]。研究表明，铁皮石斛多糖可抑制豚鼠的肠管抑制，并可抑制小鼠的胃肠推进作用[8]，对大肠杆菌有抑制作用[9]，还能调节免疫活性[10]，促进肠道健康[11]。本团队前期研究表明，铁皮石斛叶可以降低蛋鸡采食量，降低蛋破损率并且可以提高鸡蛋蛋黄颜色、蛋黄比例等蛋品质指标（未发表）。本试验旨在研究铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠微生物多样性、盲肠内容物短链脂肪酸含量的影响以及对肠道健康的影响，为铁皮石斛叶在蛋鸡生产中的应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验动物为“京红1 号”商品蛋鸡。铁皮石斛叶采摘于杭州震亨生物科技有限公司，用60℃烘箱烘干，再由破壁机打成细粉。

1.2 试验设计 采用单因素试验设计，选择19 周龄，体重相近约为1 kg、采食量正常的京红1 号蛋鸡240 只，随机分为3 组，每组10 个重复，每个重复8 只鸡。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中分别添加铁皮石斛叶干粉1 200、3 600 mg/kg。日粮中其他营养指标均满足《鸡饲养标准》（NY/T 33-2004）要求。粉料饲喂，自由饮水。试验中使用的基础日粮由杭州市爱咯禽业有限公司提供，日粮组成和营养成分见表1。

表1 基础日粮组成和营养成分

1.3 盲肠内容物样品采集 于蛋鸡273 日龄，每组随机选8 只蛋鸡进行颈椎脱臼处死，剖开腹腔取出十二指肠肠段和盲肠内容物，肠组织用生理盐水冲洗后置于2 mL冻存管中，于-80℃保存备用。

1.4 挥发性脂肪酸的测定 用万分之一天平准确称取0.5 g 盲肠内容物样品放入离心管，加入1.5 mL 超纯水，漩涡振荡3～5 min 使盲肠内容物充分溶解，然后放入离心机中，10 000 r/min 离心10 min 使固液相分离，取上清液1 mL 于2 mL 离心管中，加入0.2 mL 25%偏磷酸溶液（上清液:偏磷酸=5:1），充分混匀后冰浴30 min，再以10 000 r/min 离心10 min，用0.22 μm 滤膜过滤到气相小瓶待测。

分别取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸（购自Sigma 公司，色谱纯）1 000、400、100、200、100、100 μL，用万分之一天平称重，记录各组分重量，用超纯水定容至100 mL，配成储备溶液，于4℃避光保存待测。参照耿梅梅[12]的方法将标样储备液梯度稀释至相应浓度。采用气相色谱（岛津新气相色谱仪系统GC2010）测定乙酸、丙酸和丁酸浓度，进样量为2μL，色谱柱为HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱（30m×0.25 mm×0.25 µm），注射器/ 检测器的温度为220℃，柱温采用程序升温，80℃持续1 min 后，以15℃/min 升温至170℃后维持1.5 min，载气为高纯氮。

1.5 16S rRNA 基因测序 将采集到的盲肠内容物样本送到上海美吉生物生物医药科技有限公司进行总DNA的提取。针对16SV3-V4 区进行Miseq 扩增子测序；测序数据经拼接、质控、去接头之后获得优化序列，基于优化序列进行OTU 聚类，获得OTU 丰度表，用于后续生信分析。选择3 个组，使用Venn 图分析它们在独有和共有的OUT 数目；计算Alpha 多样性指数Shannon、Ace、observedOTUs（Sobs）、Chao1 和Coverage，并进行指数组间差异分析；对于Beta 多样性分析使用PCoA 进行结果可视化展示；用Wilcoxon秩和检验分析各菌的占比，得出差异菌。

1.6 肠道炎症和屏障基因表达量的测定 使用Trlzol 法提取十二指肠肠段的总RNA，通过ABM 反转录试剂盒中说明书的方法对十二指肠肠段RNA 进行反转录，得到cDNA。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上找到鸡的部分炎症基因和肠道屏障功能相关基因的序列，通过Primer Premier 5 设计出相对应的引物，再通过TaKaRa 实时荧光定量试剂盒（RR420-A）对相关基因的表达量进行测定。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.7 统计分析α多样性和挥发性脂肪酸数据用Excel整理，用SPSS 25 软件中ANOVA 进行单因素方差分析，并用Duncan's 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著，结果表示为平均值±标准误。

1.8 图表制作 图由美吉生物云平台网站制作（http://www.majorbio.com/）图中CON 为对照组，DO_H 为3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组，DO_L 为1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组。各基因表达量试通过GraphPad Prism 制作柱状图。

2 结果

2.1 铁皮石斛叶对蛋鸡免疫性能的而影响 由表3 可知，3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组脾脏指数、血清总蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量显著高于对照组，3 组间血清白蛋白、血清IgA 含量和血清IgM 含量无显著差异。

表3 铁皮石斛叶对蛋鸡免疫性能的影响

2.2 组内特有及组间共有OUT 分析 由图1 可知，3 个处理组共有的OUT 数目为934 个，对照组独有的OUT数目为39 个，3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组独有的OUT数目为30 个，1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组独有的OUT数目为27 个。

图1 Venn 图

2.3α-多样性分析 由表4 可知，铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠菌群OTU、Shannon、Simpson、ACE 和Chao1 均无显著数影响，1 200 mg/kg 和3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组的覆盖率相较于对照组显著提高。

表4 铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠内容物菌群α-多样性的影响

2.4 盲肠微生物结构分析

2.4.1β多样性分析β多样性分析主要是用来评判不同样本间菌群菌落结构的相似性，PCoA 分析能够反映出各个样本之间的差异大小，样本间距离越小，代表了样本间菌群结构越相似。由图2 可知，本试验中，对照组和3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组明显分离，说明3 组间菌群结构存在差异性。

图2 PCoA 分析

2.4.2 盲肠菌群结构 各组盲肠内容物样品中微生物的组成情况相近，但各种微生物所占比例有所差别，在门水平上占优势的分别为拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、放线菌门（Actinobacteriota），图3 展示了丰度大于0.1%的门水平上的菌群。在属水平上占优的分别为拟杆菌属（Bacteroides）、理研菌属（Rikenellaceae）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus），图4 展示了丰度大于1%的属水平上的菌群。

图3 盲肠菌群门水平组成和分布

图4 盲肠菌群属水平组成和分布

2.4.3 盲肠微生物门和属水平的差异菌 由图5 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组脱硫菌门（Desulfobacterota）相对丰度极显著低于对照组。由图6 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组的脱硫菌属（Desulfovibrio）相对丰度极显著低于对照组（图6-A），3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组的梅尔海拉菌属（Mailhella）相对丰度显著低于对照组（图6-B），3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg铁皮石斛叶组的α-变 形菌属（Alphaproteobacteria）相对丰度极显著低于对照组（图6-C），3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组的拟杆菌属（Bacteroidales）相对丰度显著高于对照组（图6-D）。

图5 各组脱硫菌门（Desulfobacterota）相对丰度的差异

图6 属水平上部分差异菌的各组相对丰度

2.6 铁皮石斛叶对盲肠内容物中挥发性脂肪酸的影响由表5 可知，铁皮石斛叶干粉对蛋鸡盲肠内容物中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸含量没有显著影响。

表5 铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠内容物中挥发性脂肪酸含量的影响 ng/μL

2.7 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道紧密连接蛋白及部分炎症细胞因子mRNA 表达量的影响 由图7 可知，3 600 mg/kg铁皮石斛叶组十二指肠Occludin、Cadherin、Claudin-1、Claudin-3、Claudin-5、ZO-1、ZO-2、ZO-3基因的mRNA表达量较对照组显著上调，1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组十二指肠Occludin、Claudin-3、ZO-3基因的mRNA 表达量较对照组显著上调。

图7 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道紧密连接蛋白mRNA 表达量的影响

由图8 可知，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组十二指肠IL-1β、IL-2α、TLR2、IFN-γ、TGF-β3、TNF-α基因的mRNA 表达量较对照组显著下调。铁皮石斛叶对蛋鸡十二指肠IL-6和IL-10基因表达量无显著影响。

图8 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道炎症细胞因子mRNA 表达量的影响

3 讨 论

3.1 铁皮石斛叶对蛋鸡免疫性能的影响 机体的免疫器官指数是判定机体免疫功能水平的初步指标，免疫器官的发育状况可以直接反映出机体的免疫应答水平[13]。宋美芳[14]研究表明，铁皮石斛提取物可以提高小鼠的脾脏指数。本试验中3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组脾脏指数也极显著高于其他2 组。铁皮石斛叶中起到免疫作用的主要成分是石斛多糖，它能够刺激脾脏淋巴细胞增殖[15]，从而提高机体的脾脏指数。本试验中高剂量铁皮石斛组脏器指数显著升高说明铁皮石斛叶可以在一定程度上改善蛋鸡的免疫性能。血清总蛋白和球蛋白也能够反映机体的免疫能力[16]；IgA、IgG 和IgM 由主要由B 淋巴细胞分泌，对机体体液免疫有十分重要的作用，因此免疫球蛋白水平也是判断机体免疫功能的重要指标。本试验中，3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组脾脏指数、血清总蛋白、血清球蛋白和血清IgG 含量显著高于对照组，说明3 600 mg/kg 剂量的铁皮石斛叶可以改善蛋鸡的免疫功能。

3.2 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道菌群多样性的影响α多样性中OTU、Chao1 和ACE 指数是计算菌群丰度，Shannon和Simpson 指数是用来计算菌群多样性，Coverage 指数是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低[17]。本试验中，3 600 mg/kg和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组的Coverage 指数显著高于对照组，但3 组Coverage 指数都接近于1，说明本次测序代表了样品中微生物的真实情况，而3 组间菌群丰度和多样性无显著差异。β多样性结果显示3 600 mg/kg铁皮石斛叶组与对照组菌群组成相似度较低，说明蛋鸡日粮中添加铁皮石斛可以改善盲肠菌群结构。

3.3 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道菌群组成的影响 在门和属水平上，3 600、1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组的脱硫菌相对丰度极显著低于对照组。有研究表明，脱硫弧菌（Desulfovibrio）会分解肠道中的短链脂肪酸[18-19]，使机体炎性因子水平升高。另外，脱硫弧菌还原硫酸盐产生的硫化氢[20]会破坏肠道上皮细胞从而破坏肠道屏障功能[21]。本研究中，3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组梅尔海拉菌属（Mailhella）相对丰度显著低于对照组。梅尔海拉菌属在罗曼蛋鸡肠道里会生产丁酸、硫化氢，从而破坏肠道屏障，导致多种疾病，对蛋鸡造成损害[22]。3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg铁皮石斛叶组α-变形菌属（Alphaproteobacteria）相对丰度极显著低于对照组，α-变形菌是常见的条件致病菌[23]，说明铁皮石斛叶能够抑制蛋鸡盲肠内条件致病菌α-变形菌的生长。3 600 mg/kg 铁皮石斛叶组拟杆菌属（Bacteroidales）相对丰度显著高于对照组，拟杆菌能抑制一些有害菌群的黏附与侵袭，能迅速恢复宿主失衡的内部微生态系统，维持平衡并改善宿主免疫力[24]，其成分多糖A 可抑制人原代胎儿小肠细胞IL-1β诱导的炎症，减少肠道炎症[25]。

3.4 铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠挥发性脂肪酸含量的影响 挥发性脂肪酸是肠道微生物代谢的主要产物，作为微生物与宿主之间的主要调节器，影响着肠道内的稳态和防护病原体入侵宿主[26]。但是挥发性脂肪酸具有刺激性气味，在养殖舍内浓度过高会引起动物食欲减退、免疫力下降、引发呼吸道疾病，严重的会导致肺水肿和充血[27]。本试验中各组的挥发性脂肪酸含量没有差异，说明铁皮石斛叶对蛋鸡盲肠中挥发性脂肪酸含量没有显著影响。

3.5 铁皮石斛叶对蛋鸡肠道紧密连接蛋白及部分炎症细胞因子mRNA 表达量的影响 肠道上皮细胞是构成肠道屏障的基础结构，也是肠道与机体内环境之间的物理屏障。肠上皮细胞之间不是密闭的，而是存在着间隙，间隙间被ZO、Claudins、Occludin、Tricellulin 4 类跨膜蛋白共同组成的紧密连接填充，构成了防止肠道内细菌和毒素发生转移的重要屏障[28]。Cadherin蛋白是一种CDH1基因编码的跨膜糖蛋白，在维持细胞黏附中起着至关重要的作用。Cadherin缺失可导致肠上皮细胞功能障碍[29]。本试验中，3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组十二指肠部分紧密连接蛋白的mRNA 表达量较对照组显著上调，说明日粮中添加铁皮石斛叶对蛋鸡肠道屏障功能起了一定保护作用。

肠道功能和通透性受到多种细胞因子影响，这些炎性介质可能会通过肠道屏障进入机体内环境从而进入血液，然后破坏肠道上皮细胞和肠道的完整性和功能[30]。本试验中3 600 mg/kg 和1 200 mg/kg 铁皮石斛叶组十二指肠IL-1β、TGF-β3和IFN-γ基因的mRNA 表达量显著下调。IL-1β是经典炎症因子，在肠道炎症中，IL-1β能够通过激活CD4+细胞增加促炎因子IFN-γ分泌，从而加重肠道炎症[31]。本试验中，铁皮石斛叶组十二指肠紧密连接蛋白mRNA 表达量较对照组上调，肠道通透性小，肠道内IL-β和受其调控的促炎因子TGF-β3 进入内环境的可能性变小，机体患上心脏衰竭的可能性变大[32]。另外有研究表明，IFN-γ能与TNF-a发生协同作用，通过刺激基质金属蛋白酶表达诱导一氧化氮的合成，从而对机体肠道黏膜产生损害[33]。TLR2作为TOLL 样受体家族的重要成员，能够识别病原体表面糖蛋白，诱导免疫系统将其清除，同时一些病原体会带有大量内毒素，通过促进TLR2 蛋白进一步激活巨噬细胞，进而分泌大量促炎因子，最终产生炎症反应[34]。本试验中，试验组上述提及的炎症因子的mRNA 表达量较对照组显著下调，证明日粮中添加铁皮石斛叶可以降低蛋鸡十二指肠肠道炎症。

本试验中，日粮中添加铁皮石斛叶的蛋鸡十二指肠肠段肠道屏障相关基因表达量较对照组上调，肠道炎症相关基因表达量下调，且以3 600 mg/kg 较好，主要原因是因为3 600 mg/kg 铁皮石斛叶可以有效减少盲肠菌群中脱硫弧菌（Desulfovibrio）和梅尔海拉菌属（Mailhella）这2 种产硫菌的丰度，减少肠道炎症，保护肠道屏障功能。

4 结 论

本试验条件下，在日粮中添加铁皮石斛叶干粉能提高蛋鸡免疫功能，增加盲肠菌群β多样性，降低产硫菌和条件致病菌α-变形菌的丰度，并促进肠道屏障功能，降低肠道炎症，以添加量为3 600 mg/kg 为宜。