番茄果实灰霉病拮抗细菌菌株SG－11的鉴定及其抑菌作用

崔杰，王翠翠，刘永光，赵红，张德珍，迟文娟，杨园园

(1.潍坊科技学院/山东省设施园艺生物工程研究中心/山东省高校设施园艺实验室，山东 寿光 262700；2.青岛市黄岛区自然资源局，山东 青岛 266555)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的一种世界性病害，主要危害叶片和果实，造成发病部位腐烂[1]，已成为我国温室番茄生产中高发病害之一[2]。灰葡萄孢喜低温、高湿条件，不仅在番茄生长期为害，在番茄储藏期及运输期均能侵染果实，严重时可减产60%[3]。因此，灰霉病已成为限制我国番茄安全生产的重要因素。

目前防治番茄灰霉病的主要方法为化学防治，然而由于灰霉病菌繁殖快、变异度大等使得该病菌对化学药剂极易产生抗药性[1]。对于采后果实来说，生物防治在抑制病原菌生长的同时能够保证食品的安全性，且对环境友好，因此以有效微生物取代化学杀菌剂用于果蔬采后病害的防治具有广阔的应用前景。芽孢杆菌属(Bacillusspp.)因其稳定性好、定殖率高以及防治效果好等优点，已被开发成生物杀菌剂。杨利敏等[4]测定出一株枯草芽孢杆菌的发酵滤液在离体叶片上对番茄灰霉的防治效果可达100%；Bu等[5]筛选的一株枯草芽孢杆菌L1－21对番茄果实灰霉病防效达86.57%；潘晓梅等[6]从土壤中筛选到一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其对灰霉病菌的菌丝抑制率达66.35%；童蕴慧等[7]分离获得的拮抗性强、抗菌谱广的地衣芽孢杆菌对番茄叶片和果实灰霉病的防效为70%～80%，优于50%速克灵2000倍液。目前针对番茄灰霉病生防菌的研究集中于平板对峙效果或对叶片病情的控制，而采后控制效果鲜有报道。因此，本研究从番茄根际土壤中获得一株对番茄灰霉病具有良好防效，且具有广谱真菌抗性的芽孢杆菌，并测定了其对采后番茄灰霉病抑制效果，为丰富生物防治番茄灰霉病抑病资源、开发新型农用杀菌剂提供了材料。

1 材料与方法

1.1 供试病原真菌与培养基

供试菌株:番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)、番茄灰叶斑病菌(Stemphylium lycopersici)、黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、番茄黑斑病菌(Alternaria alternata)、黄瓜黑斑病菌(Alternaria cucumerina)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum siamense)、苹果褐斑病菌(Marssonina mali)，均由本实验室分离和保存。苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)和苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)由青岛农业大学植物医学学院李保华教授惠赠；番茄早疫病菌(Alternaria solani)由中国农业大学植物保护学院吴学宏教授惠赠。所有菌株均经过单孢或单菌丝分离后保存。

供试培养基:拮抗细菌的分离和培养采用LB培养基(胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠5 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L，pH值自然)；病原菌的培养以及对峙培养采用PDA培养基(去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L，pH值自然)。所有培养基经121℃高压蒸汽灭菌20 min后备用。

1.2 番茄灰霉病拮抗细菌的分离方法

于2021年4月1日在山东省寿光地区番茄温室采集根际土壤样品，取10 g放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中于28℃、180 r/min振荡30 min，使之充分混匀，然后置于80℃水浴处理10 min。用无菌水将其稀释成10－1、10－2、10－3和10－4倍的土壤悬浮液，每个浓度吸取100 μL涂布于LB平板上，每个梯度重复3次。将平板倒置于28℃恒温培养箱黑暗培养48 h。挑取形态不同的细菌单菌落在LB固体平板上划线，获得纯化细菌菌株。

1.3 番茄灰霉病拮抗细菌初筛

将番茄灰霉病菌于25℃恒温箱中黑暗培养7 d，用无菌水冲洗菌落，使用血球计数板将孢子浓度调至1×107个/mL。取500 μL孢子悬液加入100 mL融化冷却至45℃左右的PDA培养基中，摇匀，倒入灭菌培养皿中，制成含病原菌的琼脂平板。在病原菌平板上用十字划线法接入待检测细菌菌株，28℃恒温培养48 h后观察结果。挑选出对番茄灰霉病菌有明显拮抗作用的细菌进行复筛。

1.4 番茄灰霉病拮抗细菌复筛

采用平板对峙法进行拮抗细菌的复筛。于对峙培养前3 d活化番茄灰霉病菌，同时挑取一环初筛有抑制效果的拮抗细菌加入到100 mL液体LB培养基中，28℃、180 r/min培养12 h，制备种子液。取100 μL种子液加入100 mL LB培养基中相同条件下培养48 h。对峙培养时，在PDA平板中央接种直径6 mm的番茄灰霉病菌菌饼，四周等距离2.5 cm处接种5 μL待测细菌菌液，以5 μL无菌水作为空白对照。置于25℃黑暗培养，3 d后统计细菌菌液对番茄灰霉病病原菌的抑制率。每个处理重复3个平板，试验重复3次。

抑制率(%)＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)×100。

1.5 生防细菌SG－11的抑菌谱测定

于对峙培养前3～5 d将番茄枯萎病菌、番茄灰叶斑病菌、黄瓜靶斑病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄黑斑病菌、番茄早疫病菌、草莓炭疽病菌、苹果褐斑病菌、苹果炭疽叶枯病菌和苹果轮纹病菌共10种常见植物病原菌进行活化。将直径6 mm菌饼置于PDA平板中央，距其2.5 cm处四个点滴加5 μL拮抗菌SG－11菌液，以无菌水为对照，25℃培养3～5 d后计算菌丝生长抑制率。每个处理设置3个重复，所有试验重复3次。

1.6 拮抗细菌SG－11对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果

参考1.4获得拮抗细菌SG－11的种子液，取100 μL种子液加入100 mL LB培养基中28℃、180 r/min条件下培养48 h，用LB培养基将培养液分别稀释5、10、20、40倍，平板中央放置直径为6 mm的灰霉菌饼。以无菌水为空白对照，50%腐霉利1500倍液为阳性对照。25℃黑暗条件下培养3 d，计算抑制率。

将SG－11菌液调整浓度为1×109cfu/mL，于12000 r/min离心15 min，使用细菌过滤器将上清液过滤，上清滤液用无菌水稀释5、10、20、40倍，分别取10 μL与浓度为1×105个/mL的番茄灰霉病菌孢子悬浮液(用1%葡萄糖溶液配制)等体积混合，滴到载玻片中央，于100%相对湿度下25℃培养10 h。无菌水与分生孢子的混合液为空白对照。滴加0.1%曲利苯蓝乳酚油终止萌发，检查孢子萌发率，每个浓度设置3个重复，每个玻片检测200个孢子，试验重复3次。孢子萌发率(%)＝孢子萌发数量/孢子总量×100；孢子萌发抑制率(%)＝(1－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100。

1.7 拮抗细菌SG－11的分子生物学鉴定

采用细菌通用引物27F/1492R和up－1/up－2r分别扩增16S rDNA和gyrB基因片段[8]，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，扩增产物送至深圳华大基因股份有限公司进行测序。将获得的基因序列与GenBank中已知的核酸序列进行BLAST比对，并选取近缘种序列用MEGA 7软件中的最大似然法构建系统发育树。

1.8 菌株SG－11对离体番茄果实灰霉病的抑制作用

从寿光番茄温室中采集处于青熟期的“贝贝”樱桃番茄果实，选取成熟度、果型、大小一致的果实用于接种试验。经75%乙醇果面消毒后，用无菌钉在果实赤道处打孔(直径2 mm，深度2 mm)，每个果实一个孔口。待伤口晾干后，向其加入10 mL不同稀释倍数的SG－11上清滤液(同1.6)，以无菌水处理为空白对照，50%腐霉利1500倍液为阳性对照。于22℃恒温保湿处理48 h后，每伤口接种10 μL浓度为1×105个/mL的灰霉病菌孢子悬浮液。将接种后的番茄果实置于22℃、相对湿度为90%左右的密封盒中，每24 h观察发病率与病斑扩展情况，测量病斑直径，计算防效。防效(%)＝(对照组病斑面积－处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100。每个处理接种30个番茄，试验重复3次。

1.9 数据分析

使用SPSS 25软件对数据进行统计，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 番茄灰霉病拮抗细菌菌株的筛选

从供试土壤样品中共获得28株细菌，经初筛与复筛后确定4株细菌对番茄灰霉病菌有较为稳定的拮抗效果。在对峙培养中，4株细菌对番茄灰霉病菌的菌丝具有明显的抑制作用，靠近细菌的一侧菌丝生长速度减缓或停止。4个菌株中SG－11对番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率为79.81%(图1)。

图1 拮抗细菌对番茄灰霉病菌的抑制作用

2.2 菌株SG－11对10种病原真菌的抑制作用

菌株SG－11对供试10种病原菌有不同程度的抑制作用，抑制率范围为49.07%～78.02%，具有抑菌广谱性。其中，对苹果轮纹病菌、苹果炭疽叶枯病菌和草莓炭疽病菌的抑制率均在70%以上，显著高于其他供试病原菌(表1)。

表1 拮抗细菌菌株SG－11对10种病原真菌的抑制作用

2.3 生防菌SG－11对番茄灰霉病菌生长的影响

2.3.1 对菌丝生长的影响 生防菌株SG－11对番茄灰霉病菌菌丝生长抑制率随菌液稀释倍数的增加而显著降低，SG－11原液对菌丝生长抑制率高达92.44%，显著优于50%腐霉利1500倍液(表2)；稀释5倍对菌丝生长的抑制率为87.00%，与50%腐霉利1500倍液没有显著差异；稀释40倍时防效降低为26.45%。显微观察发现，对照组菌丝直立、粗细均匀，顶端分枝较少(图2A)；加入SG－11后菌丝生长受到抑制，且发育异常，菌丝扭曲、分枝多(图2B)，有细胞质外渗现象(图2C)。

2.3.2 对孢子萌发的影响 菌株SG－11滤液对番茄灰霉病菌分生孢子的萌发有明显的抑制作用，可显著降低其萌发率(表2)。正常生长的灰霉菌分生孢子萌发后菌丝生长较快，且粗细均匀(图2D)，而经SG－11滤液处理的分生孢子萌发较慢，芽管分枝较多(图2E)，萌发率随着滤液浓度升高而降低，但稀释40倍时对孢子萌发抑制率仍高达30.73%。稀释10倍时其对孢子萌发的抑制率仍优于50%腐霉利1500倍液(表2)。

表2 菌株SG－11培养液对孢子萌发和菌丝生长的抑制作用

图2 菌株SG－11对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响

2.4 拮抗菌株SG－11的分子生物学鉴定

经16S rDNA与gyrB基因测序分别获得1064 bp和1053 bp长度的序列，经BLAST比对发现其与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的序列相似性最高，分别为98.41%与98.77%。采用MEGA 7最大似然法构建系统发育树，结果(图3)表明，16S rDNA与gyrB基因序列聚类中，菌株SG－11均与B.velezensis聚为一支，因此将拮抗菌株SG－11鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。

图3 基于16S rDNA(A)与gyrB基因(B)构建的 菌株SG－11系统发育树

2.5 菌株SG－11对番茄果实灰霉病的防治效果

处理番茄果实3 d后，调查发现不同稀释倍数的滤液均对番茄果实灰霉病有显著防效，病斑直径小于无菌水处理(图4)。使用SG－11滤液原液、稀释5倍与10倍的滤液处理番茄果实后防效均高于80%。随着滤液浓度的降低，其对番茄灰霉病的防效也逐步减弱，稀释40倍时防效仅为30.0%，低于50%腐霉利1500倍液(图4)。

图4 生防菌株SG－11对番茄果实 灰霉病的防治效果

3 讨论与结论

本研究从番茄温室土壤中筛选到一株对番茄灰霉病有较好拮抗效果的细菌SG－11，经16S rDNA与gyrB序列分析，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)。芽孢杆菌抗逆性强、在植物表面有较好的定殖能力，且防治效果好、稳定性高，已广泛应用于多种植物病害的生物防治中。据报道，特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)在室内和盆栽试验中均对黄芪根腐病表现出较好的防效[9]；番茄内生贝莱斯芽孢杆菌ZSY－1可在根部和叶部组织定殖，且对番茄植株灰霉病防效高于80%[10]。贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌亲缘关系较近，近年来已用于防治桃褐腐病、菜豆菌核病[10]、番茄青枯病和黄瓜棒孢叶斑病[11]等几十种植物病害。本研究发现拮抗菌株SG－11的抑菌谱非常广，对苹果轮纹病菌、草莓炭疽病菌和苹果炭疽叶枯病菌有非常强的抑制作用，防治效果均高于70%，表明该菌株具有成为新型生防微生物农药的潜力。

番茄采后病害常导致严重的经济损失。研究发现番茄进入储藏期后，灰霉病发生率高达40%[12]，然而储藏期果实不宜采用化学农药防控，因此生物防治成为果蔬采后病害防治的重要途径。已有研究表明贝莱斯芽孢杆菌产生的脂肽物质浸泡采后番茄果实对早疫病具有良好的防效[13]，罗伦隐球酵母菌(Cryptococcus laurentii)悬浮液浸泡樱桃番茄10 min后对灰霉病的防效达59.1%[14]。然而目前关于贝莱斯芽孢杆菌控制番茄采后灰霉病的研究较少，本研究中菌株SG－11滤液稀释10倍后对灰霉病的防效仍高于80%，表明SG－11对番茄果实灰霉病具有较好的防效。

拮抗细菌对病原菌的作用方式主要是抑制真菌分生孢子的萌发和菌丝生长以及导致病原菌菌丝畸形如顶端膨大、分支增多、细胞质外渗等[15]，这在本研究中也得到了证实。SG－11对番茄灰霉病菌孢子萌发、菌丝生长等具有显著的抑制作用，表明该菌株在培养过程中产生了抑菌物质。多项研究发现拮抗细菌或真菌能产生醇类和酮类等有机挥发物(VOCs)，也可能通过分泌脂肪类、酯类、酚类和肽类等物质来抑制病原菌生长[16－18]，但有关菌株SG－11抗菌活性物质尚不明确，还需进一步提取和鉴定。另外，生防菌除自身分泌抗菌物质外，还能提高植物防御酶活性[14，19，20]。因此，为进一步明确其抑菌机理有必要开展SG－11在番茄果实上定殖以及对番茄防御酶活性方面的研究，为该菌株活体制剂研发提供依据。