斑点叉尾鮰套肠症病原分离与鉴定

樊 威 周狄文 王 均 贺 扬 卓 婷 杨 海 吴 俊 苏 建*

（1四川省内江市农业科学院，四川内江 641000；2四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；3内江师范学院生命科学学院/长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室，四川内江 641000）

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又称沟鲶、钳鱼，属鲶形目鮰科，原产于北美洲，是一种生长性能优、抗逆性强、肉质上乘的大型淡水鱼类。自1984年引进后在全国大面积养殖[1]。随着集约化养殖的增加、种质资源的退化以及抗生素的滥用，斑点叉尾鮰疾病的暴发呈逐年递增趋势。报道显示，斑点叉尾鮰细菌性疾病危害最大，包括细菌性败血症、肠型败血症、柱形病、套肠症等[2]。近几年，斑点叉尾鮰套肠病在各地频繁暴发，往往发病突然、传染迅速、死亡率居高不下，给斑点叉尾鮰养殖业造成了巨大损失。以往报道显示，斑点叉尾鮰套肠症主要由嗜麦芽寡养单胞菌引起[3]，后来有人发现气单胞菌属的细菌也能引起套肠症[4-5]。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属弧菌科气单胞菌属，是典型的人-兽-鱼共患病病原[6]。据目前的相关报道，各类淡水鱼均可感染嗜水气单胞菌，多数鱼类感染嗜水气单胞菌后均表现为典型的败血症，但情况略有不同。嗜水气单胞菌可致异育银鲫发生溶血性腹水病[7]、黄颡鱼发生腹水病[8]以及草鱼发生细菌性败血症[9]等。

2020年10月底，随着气温突然回升，四川省乐山地区养殖斑点叉尾鮰出现爆发性死亡，主要表现为体表脱黏、体色变淡以及肠道套叠等症状，造成当地养殖斑点叉尾鮰大量死亡。为了弄清此次斑点叉尾鮰发病死亡原因，本研究采集症状明显的患病斑点叉尾鮰进行了生物性病原检测，并对分离细菌进行了药物敏感试验，以期为该细菌引起斑点叉尾鮰套肠症的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试验对象。患病活体斑点叉尾鮰4尾（33±5 cm），由四川省乐山市井研县某斑点叉尾鮰养殖场提供；20尾健康斑点叉尾鮰，由长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室提供。

1.1.2 试验试剂。脑心浸液培养基（BHI），购自北京欣经科生物技术有限公司；细菌生化微量鉴定管，购自杭州天和生物试剂有限公司；Master mix和细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；水质快速分析试剂盒，购自湖南渔美康生物技术公司。

1.2 试验方法

1.2.1 现场调查。通过现场调查的方式，询问养殖户近期斑点叉尾鮰死亡情况以及用药情况，并且观察、记录水体颜色。使用赛氏透明度盘测定水体透明度并记录。使用水质快速分析试剂盒测定患病鱼池塘中的氨氮、亚硝酸盐、pH值以及溶解氧含量。

1.2.2 剖检观察。取患病斑点叉尾鮰，观察其体表、头部、鳃盖、鳃丝、眼球、鳍条、肛门等部位有无明显病变并记录，解剖患病斑点叉尾鮰内脏观察并记录。

1.2.3 寄生虫检测。取少量患病斑点叉尾鮰鳃丝、体表黏液以及肠道黏液压片，置于显微镜下观察并记录是否有寄生虫产生。

1.2.4 细菌的分离与纯化。按无菌操作的方法，取病变明显的斑点叉尾鮰肝脏、脾脏和肾脏，在无菌环境下接种于BHI琼脂培养基上，于28℃恒温培养箱中培养18～24 h后进行革兰氏染色并观察其纯度，纯度较大的部位划线接种到一个新的BHI琼脂培养基上进行扩配，得到纯化的菌株后使用甘油保存。

1.2.5 病原菌形态学鉴定与生化鉴定。将纯化完的菌株接种于BHI培养基上于28℃培养24 h，观察其菌落形态大小。经过革兰氏染色后，置于光学显微镜下观察菌体的形态特征，并拍照或画图记录。之后挑取单个菌落接种于微量生化管中，在28℃下培养24～48 h。

1.2.6 分子生物学鉴定。分别挑取分离得到的不同形态病原菌，接种于无菌BHI液体培养基，28℃过夜振荡培养。取2 mL菌液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌DNA。采用细菌16S（16S rRNA）和gyrB基因通用引物（表1）进行PCR扩增，引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。反应在25 μL体系中进行：PCR Premix 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物 1.0 μL， 模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR循环参数：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循环扩增30次，最后72℃延伸10 min，于12℃结束反应。预计扩增片段约1 500 bp和1 200 bp。以1%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，将预期片段PCR送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

表1 细菌16S rRNA和gyrB基因通用引物

1.2.7 序列比对与构建系统进化树。将所测得的序列提交GenBank获取相应登录号，并在NCBI网站中进行相似性搜索。选取相似性较高的典型序列与病原菌序列进行比对，构建系统进化树，确定菌株分类和进化地位。

1.2.8 致病菌株毒力测定。先将分离纯化后的菌株接种于BHI平板上，于28℃培养24 h后，用0.85%无菌生理盐水1 mL清洗菌苔备用，并用革兰氏染色检验菌株纯度。之后，按菌液0.4 mL和生理盐水3.6 mL的比例，用麦氏比浊法调整细菌浓度。试验组按照1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL 的浓度对斑点叉尾鮰腹鳍基部进行注射感染，每组注射5尾健康斑点叉尾鮰，注射剂量为0.2 mL/尾；对照组注射等量无菌生理盐水。试验时间为1周，在此期间不进食，用塑料箱暂养且水温保持在（25±2）℃，连续增氧24 h，观察斑点叉尾鮰的活动情况、发病症状和死亡情况，并对死亡斑点叉尾鮰进行细菌检查。

1.2.9 药敏试验。无菌环境下采用纸片扩散法（K-B法）进行。取分离纯化的细菌，用接种环挑取形态、大小一致的菌落在新平板上划线；然后加入0.85%生理盐水1 mL，使用无菌棉签均匀涂布于接种的平板上。将21种含常用抗菌药的纸片贴在平板上，28℃培养24 h后测定抑菌圈直径的大小，判断病原菌对药物的敏感程度。

2 结果与分析

2.1 现场检查情况

该池塘斑点叉尾鮰发病时间约为1个月，发病鱼症状主要表现为行动迟缓，食欲减退，肛门红肿，体表色淡、脱黏，部分鱼体表有圆形褪色斑或口腔出血并有淡黄色污物附着，死亡量较大，严重时死亡量达到1 000～1 500 kg。

2.2 病鱼的临床症状

病鱼体色变淡、黏液减少，肠道出现明显套叠。解剖后发现肝脏发红出血，脾肾肿大、出血，胃和肠道出血、发炎，部分脑内充血、出血（图1）。

2.3 寄生虫检测

鳃丝压片结果表明，鳃丝压片未观察到寄生虫。体表黏液压片表明，体表黏液中未观察到寄生虫。

2.4 细菌分离、纯化

利用穿刺接种技术将病变明显的肝脏、脾脏和肾脏划线接种于BHI培养基，28℃恒温培养24 h后，培养基上形成圆形、表面光滑的半透明乳白色针尖状菌落，分别挑取单菌落经革兰氏染色，置于显微镜下观察，确定分离细菌为革兰氏阴性短杆菌（图2）。

2.5 细菌检测PCR扩增

以分离菌株的DNA为模板，用细菌16S rRNA和gyrB基因通用引物进行PCR扩增，经电泳检测和凝胶成像后，16S rRNA基因于1 500 bp左右得到其目的条带，gyrB基因于1 300 bp左右得到其目的条带（图 3）。

2.6 系统进化树的构建

将分离菌株的16S rRNA序列（LSCC20201）与gyrB序列（LSCC20202）于 GenBank中查找相关序列，在NCBI网站中进行Blast分析，选择与该序列具有较高同源性的核酸序列。按照以上方法，在基因库里下载嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、点状气单胞菌、杀鲑气单胞菌和荧光假单胞菌共5类已公开的序列，与菌株序列在MEGA 6.0软件中进行多次比对，最后采用N-J法构建系统进化树，通过Bootstrap检验分析各分枝的置信度。在16S rRNA序列、gyrB序列上，分离菌株均聚在嗜水气单胞菌的分支上。从生理生化试验结果来看，菌株为嗜水气单胞菌（图4）。

2.7 人工感染试验

将分离纯化菌株培养后稀释成 1.2×109、1.2×108、1.2×107CFU/mL的浓度对斑点叉尾鮰进行腹腔注射（0.2mL/尾），24 h后，斑点叉尾鮰开始出现死亡现象，主要表现为急性充血、出血，72h死亡率达高峰（表2），且部分出现套肠症状。对照组未出现死亡。

表2 人工感染试验结果

2.8 药敏试验

为进一步判断病原菌对药物的敏感程度，选取21种常用抗生素，采用纸片法，分别对分离得到的菌株进行混合药敏试验（图5）。该菌株对氧氟沙星和氟苯尼考敏感，对其他药物低度敏感或不敏感，具体结果见表3。

表3 患病鱼分离菌株的药敏试验结果

3 结论与讨论

3.1 讨论

斑点叉尾鮰套肠症又称为斑点叉尾鮰肠套叠症，1988年在美国就有斑点叉尾鮰类似肠断裂的疾病报道，并且从病鱼器官中分离到嗜水气单胞菌、假单胞菌（Pseudomonas spp.）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）和柱状黄杆菌（Flavobacterium columnar）等多种细菌[10]，但没有证据将这些分离细菌与疾病之间的关系建立起来。汪开毓等[11]认为，嗜麦芽寡养单胞菌是斑点叉尾鮰套肠症的病原，但其致病性较嗜水气单胞菌更高，患病斑点叉尾鮰更易出现脱肛现象。之后，也有研究报道显示，嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌等细菌也能够引起斑点叉尾鮰套肠症[4]。研究发现，套肠症发生时间过长，易引起肠道缺血，降低消化能力，引起肠炎，甚至破裂引起全身性继发感染，造成鱼体死亡[3]。

本研究将分离菌株进行回归试验，发现新感染斑点叉尾鮰出现相似症状，随后通过与16S rRNA序列与gyrB序列进行比对，确定该病原为嗜水气单胞菌。斑点叉尾鮰发病症状主要为体色变淡，有褪色斑现象，鳍条基部发红，肛门红肿，脱肛现象较少，内脏器官表现为典型的肠道套叠并伴有出血和肠炎迹象，脾脏充血肿大，与嗜水气单胞菌引起的败血症有较大差异，但也有相似之处。这可能与不同嗜水气单胞菌分离株的毒性、流行水温及宿主差异有关[12]。嗜水气单胞菌导致水产动物致病主要与外分泌物中一些毒力因子有关，包括外毒素和胞外酶[13]。这些毒素和酶往往使被感染鱼类发生不可逆的病变，如溶血素能破坏各种细胞（包括白细胞），肠毒素能引起患病鱼肠道细胞损伤，从而导致炎症及套肠等症状。本试验中，患病斑点叉尾鮰出现肠炎、肠套叠等症状，可能与嗜水气单胞菌携带的这些毒力因子有关。

除此之外，斑点叉尾鮰爆发性死亡与放养密度和池塘环境也有关系。调查发现，养殖场养殖密度较大，池塘底质淤泥较多，池塘底部堆积了大量残饵粪便，为有害细菌群提供了适宜的生长和繁殖环境，导致养殖水体偏黄略带浑浊，池塘中氨氮、亚硝酸盐含量均严重超标，最终引起鱼体的抵抗力和免疫力下降；同时，该病主要发生在冷水或凉水水域中（水温12～19℃）[14]。本次发病期气温突然上升（水温达到15℃左右），斑点叉尾鮰代谢突然加快，推测可能是本次致病菌感染发病速度较快的原因之一。后期通过改善水质，降低了养殖场斑点叉尾鮰的死亡率。

在水产动物养殖过程中，合理、有效地使用抗生素是治疗鱼类细菌性疾病的重要措施之一。本试验对分离菌株进行了药物敏感性分析，结果表明，致病菌株对氟苯尼考及氧氟沙星敏感。吴 璇等[4]在研究嗜水气单胞菌引起的斑点叉尾鮰套肠病时，也发现该分离菌株对喹诺酮类药物敏感。喹诺酮类抗生素氧氟沙星已经在水产动物养殖中禁止使用，因而临床上可以选取氟苯尼考治疗该疾病。

3.2 结论

本试验通过细菌分离鉴定和人工感染试验，确定了引起斑点叉尾鮰套肠症的病原为嗜水气单胞菌；通过药敏试验，得出分离菌株对氟苯尼考和氧氟沙星敏感。试验结果可为临床中由嗜水气单胞菌引起的斑点叉尾鮰套肠症的防治提供参考。