应用分子标记辅助选育粳稻香型软米新品系研究

田孟祥 赵 龙 何友勋 张时龙 余本勋 叶永印

（毕节市农业科学研究所，贵州毕节 551714）

水稻是我国主要的粮食作物之一，是我国大部分人口的主要食物来源[1]。随着人们生活水平的改善，对稻米品质的要求也不断提高，由“吃得饱”向“吃得好”转变，而“吃得好”主要体现在优良食味。软米是一种优良食味大米，直链淀粉含量较低，介于一般糯米与黏米之间，蒸煮的米饭具有晶莹剔透、爽口舒适、冷后不回生不变硬等优点[2]，深受消费者欢迎。香米因其具有独特的芳香气味，备受青睐。因此，培育含软米和香味2种类型基因的优良食味水稻品种以满足市场和消费者的需求，已成为水稻育种中最重要的研究目标。

水稻低直链淀粉基因Wx-mq、甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2分别作为控制软米和香味的重要基因之一，在育种中被广泛利用。然而，同时含有以上2种基因的新品种却并不多见。本研究将含Badh2基因的育种中间材料DHX611（母本）与含Wx-mq基因的南粳9108（父本）进行组配杂交，结合分子标记辅助选择，选育出含以上2种目标基因的香型软米新品系香软粳7002，经初步鉴定表现良好，为下一步的开发利用奠定了基础，也丰富了贵州省粳稻香型软米的育种实践。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DHX611：母本，水稻育种中间材料，为稻花香2号和毕粳611的杂交后代，遗传性状已稳定，含来源于稻花香2号的香味基因Badh2。

南粳9108：父本，引自江苏省农业科学院，为优良食味软米品种，含低直链淀粉基因Wx-mq[3]。

1.2 试验方法

1.2.1 香型软米新品系香软粳7002的选育。2014年正季以自育水稻育种中间材料DHX611为母本，以引进的南粳9108为父本进行杂交，获得F1；同年冬繁种植于海南三亚，后经贵州毕节与海南三亚两地多年交替加代选育而成。根据育种目标，从F2开始，每个世代选农艺性状较好的单株，结合Wx-mq、Badh2这2个基因分子标记鉴定，选留农艺性状好且含以上2个目标基因的单株，于2020年选育成香型软米新品系，暂定名为香软粳7002。

1.2.2 软米基因和香味基因分子标记鉴定。这2个基因的主要鉴定步骤如下。

（1）水稻叶片取样。在分蘖期，将各单株水稻编号，取其新鲜叶片2～3片，放入4号自封袋中，保存在-20℃冰箱中冷冻备用。

（2）水稻叶片研磨。DNA提取时叶片研磨参照田孟祥等[4]的烘干法进行制备，取先前存于冰箱冷冻的水稻叶片约0.4 g，放入2 mL的离心管中，然后将该离心管置于鼓风干燥箱中进行干燥，干燥箱温度设置为60℃，烘烤时间为24 h；取出离心管，放在离心管架上固定，用塑料研磨棒伸入离心管内，上下来回敲击叶片，搅碎成粉状。

（3）水稻DNA的提取。向装有已粉碎叶片的离心管中加入1.5 mL的温热CTAB提取液（2%的CTAB，100 mmol/L 的 Tris-HCl，20 mmol/L 的 EDTA，1.4 mmol/L的NaCl），65℃水浴1 h，期间摇匀数次；在转速12 000 r/min条件下离心10 min，回收上清液0.9 mL于2 mL离心管；加入24∶1氯仿异戊醇溶液0.9 mL，震荡 15 min；在转速12 000 r/min条件下离心10 min，小心吸取上清液0.5 mL于1.5 mL离心管；加入 0.05 mL的 NaAC（3 mol/L）和 0.9 mL的-20℃无水乙醇，混匀，置于-20℃冰箱中静置5 h以上甚至过夜；在转速12 000 r/min、冷冻离心机-10℃条件下离心10 min，倒出废液；将离心管放在超净工作台上风干，加入去离子水溶解DNA备用。

（4）软米基因Wx-mq分子鉴定。参照陈 涛等[5]的方法，该标记由4条引物组成，即：

Wx-mq-O-F：5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTT GCAGGC-3'；

Wx-mq-O-R：5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTT TCCCCAA-3'；

Wx-mq-I-F：5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCT ACAATCG-3'；

Wx-mq-I-R：5'-GTCGATGAACACACGGTCGA CTCAAT-3'。

反应体系为20μL，反应程序：94℃预变性5min，94℃变性 30 s、65℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30个循环，72℃延伸10 min。反应产物采用琼脂糖凝聚电泳检测，参照田孟祥等[6]的方法进行。

（5）香味基因Badh2分子鉴定。参照陆艳婷等[7]的方法，略有修改，标记由4条引物组成，即：

ESP：5'-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3'；

EAP：5'-AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-3'；

IFAP：5'-CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3'；

INSP：5'-CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-3'。

反应体系、反应程序及产物检测参照上述软米基因Wx-mq分子鉴定方法进行，但退火温度改为57℃。以上所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 调查内容与方法

水稻农艺性状考查按照《国家水稻品种试验观察记载项目、方法及标准（试行）》进行，主要考查产量、株型、生育期、株高及穗粒性状等参数指标。

稻谷收获后，阴干，除杂，取300 g送至农业农村部食品质量监督检验测试中心（武汉）进行稻米品质指标检测。

2 结果与分析

2.1 软米基因Wx-mq的分子检测鉴定

采用陈 涛等[5]设计的Wx-mq基因功能标记对目的基因进行检测，该功能标记基于单核苷酸突变的扩增受阻突变体系PCR技术，由4条引物组成，内、外引物各2条，即正向外引物Wx-mq-O-F、反向外引物Wx-mq-O-R、正向内引物Wx-mq-I-F、反向内引物Wx-mq-I-R。根据设计原理和引物所处的DNA序列位置，所有的水稻植株均能扩增出片段大小为439 bp的条带，在含纯合软米Wx-mq基因的水稻植株可扩增出片段大小为292 bp的特征条带，在普通不含Wx-mq基因的水稻植株可扩增出片段大小为200 bp的特征条带，而杂合基因型则扩增出以上3种条带类型。在香软粳7002的选育过程中，从F2开始，对农艺性状较好的单株，利用Wx-mq基因功能标记对目的基因进行检测鉴定，选择含纯合和杂合目的基因的植株继续下一代的种植，如此重复鉴定，直至性状遗传稳定。Wx-mq基因功能标记对F2的检测情况如图1所示。

从图1可以看出，在F2群体的泳道4、8、16扩增出片段大小为439bp和292bp条带，与在泳道1的亲本南粳9108的扩增带型一致，为含纯合Wx-mq基因植株；泳道 5、6、10、11、15、17、18 扩增出片段大小为439bp和200bp条带，与在泳道2的亲本DHX611的扩增带型一致，为不含Wx-mq基因植株；而泳道7、9、12、13、14 扩增出以上所有条带类型，与在泳道3的F1植株的扩增带型一致，为含杂合Wx-mq基因植株。

根据育种目的，仅保留含纯合和杂合Wx-mq基因植株的种子，下一步继续进行鉴定，其他不含目的基因的植株进行舍弃处理。

2.2 香味基因Badh2的分子检测鉴定

对已确定含Wx-mq基因的植株，再利用陆艳婷等[7]报道的香味基因Badh2功能标记对该香味基因进行检测，该功能标记由4条引物组成，即引物ESP、引物EAP、引物IFAP以及引物INSP。根据引物所在DNA序列的位置，由引物ESP和EAP扩增出的大小为580 bp左右的条带（非香稻为585 bp，香稻为577 bp）在每个植株样品中均呈现，主要起到阳性对照的作用，同时它也可以有效地降低非特异PCR产物的扩增和引物二聚体的形成[8]；在含纯合香味基因Badh2的水稻植株中能扩增出257 bp大小的条带，在不含香味基因Badh2的植株中扩增出355 bp大小的条带，而杂合基因型则扩增出以上3种条带类型。香味基因Badh2功能标记对F2植株的检测情况如图2所示。

在 F2群体检测图谱中，泳道 4、7、12、16 扩增出的带型与在泳道1的亲本南粳9108一致，扩增出大小约为580 bp和355 bp条带，为不含香味基因Badh2 的水稻植株； 泳道 6、8、10、13、17、18 扩增出的带型与在泳道2的亲本DHX611一致，扩增出大小约为580 bp和257 bp条带，为含纯合香味基因Badh2的水稻植株；而泳道5、9、14、15扩增出的条带与在泳道3的F1带型一致，扩增出以上3种带型条带，为含杂合香味基因Badh2的水稻植株。不含目的基因的水稻植株种子在本轮鉴定中淘汰，反之继续下一代的选择与鉴定。其他世代目标基因检测也按上述检测鉴定方法，不再另叙。

2.3 农艺性状

经过考查，香软粳7002株型较紧凑，分蘖力较强，叶色淡绿，叶姿较挺，弯曲穗，抗倒性较强，后期熟相好，平均产量为8 034 kg/hm2，全生育期163 d，株高102.8 cm，有效穗288万穗/hm2，穗长18.7 cm，穗总粒数167.3粒，结实率93.2%，千粒重26.8 g，综合农艺性状好。

2.4 稻米品质

经农业农村部食品质量监督检验测试中心（武汉）检测，香软粳7002的出糙率为82.1%，精米率为72.9%，整精米率为63.0%，粒长5.5 mm，长宽比2.0，垩白粒率18.0%，垩白度2.5%，直链淀粉含量11.8%，胶稠度90 mm，碱消值7.0级，透明度1级，气味为香。由检测指标可见，水稻香软米7002除具有香味和低直链淀粉特性外，垩白粒率和垩白度都较低，展现出良好的外观品质，商业价值潜力较高。

2.5 香软粳7002的有机种植表现

随着人们生活水平的不断改善，对于稻米，不再仅限于“好吃”，也更加关注于“吃得健康”。香软粳7002兼具香和软的特性，爽口舒适，食味优良，应用前景好。

为满足人们“好吃”和“吃得健康”的需要，2021年正季，在自然生态条件良好的贵州省毕节市七星关区田坝镇开展了香软粳7002有机种植试验。在试验种植过程中，除底肥施用农家肥外，全程未施用农药和化肥。根据调查，在此种植方式下，除分蘖力相对较弱外，其他农艺性状均表现较好，生育期适中，根系吸收能力强，籽粒饱满，结实率高，熟相好，产量较高，达7 242 kg/hm2，推广潜力看好。香软粳7002有机种植试验的田间表现如图3所示。

3 结论与讨论

软米蒸煮的米饭具有质地柔软、滋润爽口等特性，适口性好，食味佳，颇受消费者欢迎。我国最早种植软米的区域主要为西南地区，尤其是云南，典型的品种为毫屁、毫民等，曾在古代列为宫廷贡品，之后更是被列为国家级优质上等米[9]。从有关文献报道来看，20世纪80年代提出的低直链淀粉含量育种目标，成为软米研究发展的起始点[10]。

随着社会的进步与发展，人们对软米的需求日益增加，软米新品种的选育已成为许多水稻育种工作者重要的育种目标。近年来，在水稻育种工作者的不断努力下，我国多个省份新的软米品种不断呈现，选育出南粳 46[11]、云粳 20 号[12]、南粳 5055[13]、南粳9108[14]、丰粳 1606[15]、南粳 5718[16]、银香 38[17]等一系列软米品种，在一定程度上满足了种植者和消费者的需求。

香稻具有一种特殊气味性状，颇受人们偏爱，也一直是育种者关注的重点。

在现代育种技术日益发展的今天，分子标记辅助选择已经成为水稻育种的一个重要辅助手段，具有不受环境条件影响和选择效率高等优势，颇受育种者青睐[18]。目前，贵州省尚未有自育粳稻香型软米品种的报道，外来品种多出现“水土不服”现象，难以适应贵州省特殊的山地高原气候条件。笔者所在的育种团队基于贵州省特殊的气候生态条件，引进省外含软米Wx-mq基因的水稻品种南粳9108与育种中间材料DHX611进行组配杂交，采用传统农艺性状选择与分子标记辅助选择相结合的方法，选育成了粳稻香型软米新品系香软粳7002，丰富了贵州省粳稻香型软米育种实践。经初步试验鉴定，香软粳7002表现良好，下一步将扩大鉴定范围，以便收集更多数据为科学指导其应用提供重要参考。