转基因玉米培育及其检测技术应用研究

李 晶 尹祥佳 王雅琳

（兰州职业技术学院，甘肃兰州 730070）

玉米是全球及我国第一大粮食作物，也是草食畜牧业和饲料行业的重要作物，其作为杂种优势研究和应用非常广泛，对稳定我国粮食生产安全，调整农业种植结构，增加农民收入等都具有重要的贡献。根据国家统计局数据显示，我国2020 年玉米播种面积为 4126.4 万hm2，玉米产量约2.6 亿t。预计到2030 年，我国玉米生产的需求量将达到3.03 亿t[1-2]。为保障玉米种植业的持续稳定发展，需要加大玉米新种质的选育，常规的玉米品种选育是通过选择育种、杂交育种、回交选育、诱变育种、群体改良等育种方法的集成育种，但选育周期较长，材料自主创新难度较大，再加上玉米种子品种的市场化程度较高，为了获取更多的效益，往往导致玉米种质遗传基础狭窄，市场上的品种同质化趋势加大，都会对玉米的生产带来一定的难度。随着基因工程技术和分子生物学技术的发展，以转基因技术为代表的生物技术在玉米品种选育过程中的应用作用日益凸显，尤其是通过育种设计，将生物技术育种与常规育种技术的结合，成为了重要的玉米新品种选育途径。

1 玉米转基因技术

转基因技术也称之为基因工程技术，在农业领域的应用非常广泛，包括玉米转基因研发在内的粮食作物品种的选育和改良成为了重要的农业科技攻关方向。1983 年世界上首次报道了转基因烟草的研发成功，带动了我国转基因作物育种。通过转基因技术的应用加速玉米种质资源的创新，在玉米种质改良过程中发挥着重要的作用[3]。1986 年我国启动了国家高技术研究发展规划，也就是“863”计划，将转基因植物在内的生物技术研发作为重点支持研究领域，随着研究的深入开展和积累，我国培育了自主知识产权的抗虫转基因棉花，并投入商业化生产。此外，国家重大基础研究计划（“973”计划）也将转基因育种列为重要的支持研究领域，特别是2008 年我国开始实施的转基因生物新品种培育国家科技重大专项，有效实现了包括玉米在内的五大作物的转基因育种和常规育种的深度结合，研发出了一批重要的新品种和新材料。由中国农业科学院生物技术研究所和北京奥瑞金公司联合研发并于2009 年获得了原农业部颁发的转植酸酶基因玉米自交系的安全证书，成为了我国转基因玉米研究的重要创始之作[4]，2015 年转植酸酶基因玉米再次获得安全证书。2019 年北京大北农生物技术有限公司的DBN9936 和杭州瑞丰生物科技有限公司的双抗12-5 获得安全证书。2020 年北京大北农生物技术有限公司研发的耐除草剂转基因玉米获得农业农村部科技教育司颁发的农业转基因安全证书，有效期为5 年。2021 年中国农业大学国家玉米改良中心培育的抗虫玉米ND207 获得生物安全证书，杭州瑞丰研发的浙大瑞丰8 抗虫和耐除草剂转基因玉米、北京大北农生物技术有限公司研发的DBN3601T 双价抗虫和耐除草剂转基因玉米获得转基因玉米安全证书。2022 年杭州瑞丰耐除草剂玉米和中国种子集团有限公司的3 个转基因玉米获得转基因安全证书。转基因玉米研发的常用转基因技术有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。

1.1 农杆菌介导法农杆菌是自然界存在的，农杆菌介导的玉米遗传转化方法是最常用，也是最有效的玉米转化方法。在试验操作层面是将待转化的外源目的基因整合到经过改造的遗传转化的T-DNA 区，借助农杆菌侵染植物的细胞，实现外源基因与植物基因组的转移与融合[5]，再利用植物组织培养再生体系，培育出转化再生的植物植株，再进一步进行转基因的检测确定以及后代转化的稳定性分子和植物生理学鉴定，得到稳定表达的转基因植株。谢超等[6]采用农杆菌转化方法将提高玉米籽粒类胡萝卜素基因chyb基因和耐草甘膦bar基因转入玉米品种7922 中，获得品质改良和抗除草剂的玉米育种材料。王阳等[7]对抗虫基因cry1Ab进行改造后获得新的基因cryFLIa，用农杆菌转化HiII 玉米幼胚，通过转基因检测抗性和转化后代的抗病鉴定试验得到了抗亚洲玉米螟的玉米材料。农杆菌介导玉米转化方法主要的转化受体为玉米幼胚诱导的愈伤组织、玉米幼胚、玉米黄化苗的茎尖，农杆菌的菌株主要有EHA105、C58 和LBA4404。

1.2 基因枪法基因枪法是一种物理的转化方法，又称为粒子枪法，是采用高速的金属微粒表面的外源DNA 分子随机整合到植物受体细胞中[8]。李志亮等[9]选用玉米自交系京501 诱导的愈伤组织，采用基因枪法转化P5C5基因获得转基因材料，并进行了抗旱性鉴定，结果显示P5C5基因能够在干旱胁迫下通过基因的表达提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量来提高转基因玉米的抗旱性。韩平安等[10]用基因枪对玉米自交系A188 诱导的幼胚愈伤组织进行转化cp4EPSPS基因，获得抗草甘膦转基因玉米材料。基因枪法转化玉米的主要受体材料有幼胚、愈伤组织和茎端分生组织[11]。

1.3 花粉管通道法花粉管通道法最早应用在烟草的转化当中，我国学者周光宇于20 世纪80 年代创立了花粉管通道转化技术，主要是采集植物花粉进行处理，然后利用天然花粉管通道将外源DNA 目的基因携带进入胚囊实现外源基因的遗传转化[12]。韩猛等[13]选用玉米自交系京24，将BADH基因通过花粉管通道法进行转化，并对T2转基因植株进行了耐盐性生理指标的鉴定，得到了耐盐性自交系材料。陈丽娟等[14]选用玉米自交系京517、京501 和吉444，构建了bar基因为筛选标记基因和CspB为目的基因的双价植物表达载体，通过花粉管通道法实现了转化受体材料的耐旱性和耐除草剂等性状改良。花粉管通道法因受到外界环境的影响较大，所以最好选择晴天进行试验，这样可以减少花粉质量对转化效率的负面影响。除此之外，外源DNA 片段的大小、浓度、纯度，田间导入量和导入时间也是影响转化效率的因素。近些年，采用超声波辅助花粉介导的方法能够有效提高转化效率，不受实验室植物组织培养的限制。

2 转基因玉米培育

目前，转基因玉米培育的目标性状主要是在抗虫转基因玉米、耐除草剂转基因玉米、耐干旱和品质改良转基因玉米等方面[15]。

2.1 抗虫转基因玉米在玉米种植过程中，虫害导致的玉米减产较为普遍，主要为棉铃虫、亚洲玉米螟和黏虫的危害。为了减少化学防治带来的环境问题，通过转基因技术培育抗虫转基因玉米品种，保障玉米生产安全是一项重要的路径[16]。陈沼汀等[17]选用玉米自交系H99 幼胚为转化试验材料，用农杆菌介导转化法将抗虫基因cry1Ab13导入到玉米基因组中，通过分子检测和田间抗虫鉴定，对玉米螟的抗性显著提高。王建军等[18]以郑58 和昌7-2 玉米自交系为试验材料，用花粉介导法将cry1Ac基因导入玉米基因组中，然后进行多代 PCR 检测和Southern杂交分析，获得纯合的转基因株系。在抗虫转基因玉米培育过程中，抗虫的评价试验是非常重要的环节，尤其是转Bt玉米对于玉米螟、黏虫、棉铃虫有一定的抗性，能够抑制黏虫生长发育[19]。同时还要根据不同玉米种植区害虫发生情况实行分区域布局，研究进行管控的转基因抗虫玉米种植应对策略[20]。

2.2 耐除草剂转基因玉米玉米在种植生产过程中与各种田间杂草争夺水分和营养物质，导致其生长过程中的营养成分积累和产量受到抑制，因此，作为一种广谱内吸传导性除草剂，草甘膦是目前使用量最大的除草剂品种之一，而耐除草剂草甘膦转基因玉米研究和应用是重要的转基因玉米材料培育的方向[21]。耐草甘膦基因通常作为表达载体构建中的筛选标记基因，与其他目的基因同时实现遗传转化，能够获得复合性状的转基因玉米材料。余桂容等[22]以玉米自交系18599 和综31 幼胚为转化受体，通过筛选、检测，获得了耐除草剂和抗虫的双抗玉米亲本育种材料。刘苗苗等[23]选用玉米Hi-Ⅱ为转化受体材料，用农杆菌介导法将耐草甘膦基因G10ev导入受体材料基因组中并进行了抗性鉴定，培育出了具有自主知识产权的耐草甘膦玉米转化系AG16。

2.3 耐旱转基因玉米由于水资源的短缺，加之农业灌溉用水条件的不同，旱作农业的发展急需耐旱转基因玉米品种的培育。相关研究表明，干旱每年导致作物减产达50%以上，随着我国耐旱转基因玉米的研究发展，耐旱基因主要分为转录因子、酶类和其他抗旱相关蛋白基因[24]。郑成忠等[25]以T4转BADH基因玉米自交系丹988 为材料，经过加代对T5和T6转基因植株进行基因表达稳定性、生理生化指标测定、田间耐旱性分析，培育了耐旱玉米新种质资源。冷益丰等[26]研究了转入抗旱基因TsDREB2A、CBF4和PIS的13 份玉米自交系种子材料的萌发期抗旱性。因此，耐旱基因的挖掘以及转化玉米材料评价是培育耐旱玉米品种的有效途径。

除此之外，品质改良转基因玉米品种主要与抗虫、耐除草剂的多基因聚合转化，获取复合性状的转基因玉米新材料。邹俊杰等[27]研究了含有Cry3Bb、Cry1Ab、cp4epsps、ZmTMT和ZmHPT5个基因聚合的转基因材料，具有抗虫、耐除草剂和提高维生素E 含量等性状的遗传稳定性表达。将多基因聚合转化和常规育种技术相结合，培育多种符合性状的转基因玉米材料具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

3 转基因玉米检测技术

转基因玉米检测技术主要有两类，一是以核酸为检测对象的PCR 法，包含普通PCR 检测、多重PCR 检测和实时荧光定量PCR 检测；二是以蛋白质为检测对象的检测法，常用的有试纸条转基因检测。核酸检测方法是应用PCR 技术开展转基因玉米成分的检测方法。阳丽等[28]根据常见的玉米内源基因CaMV35S启动子和NOS终止子，转化的外源目的基因设计检测引物，通过优化检测体系，建立PCR 初步的筛选检测方法。尹全等[29]研究了转基因玉米筛查的多重PCR 检测方法，构建了进口转基因玉米基因元件P-CaMV35S、P-ract1、T-NOS、pat、bar和PMI等元件的组合筛选检测体系，对我国进口的转基因玉米进行快速和有效的检测。袁磊等[30]设计特异性引物和Taqman 探针，通过实时荧光PCR 技术建立玉米MON88017 特异性检测方法，检测结果的灵敏度和准确性都比较高，可以满足国际上关于转基因的1%检测底限要求。作为蛋白质检测方法的试纸条分为样品垫、衬板、吸收垫、结合垫、NC 膜、检测带和控制带，已经成为了商品化的试纸。检测时将样品研磨，溶解后获取蛋白质溶液，再用试纸检测读取结果，转基因检测试纸在玉米转基因检测中应用非常方便，能够显著提高检测效率。