抗栓胶囊中黄曲霉毒素的含量测定及安全性评价

薛平，顾峥嵘，刘旻虹，李莉（常州市食品药品纤维质量监督检验中心，江苏 常州 213000）

抗栓胶囊由当归尾、水蛭、土鳖虫、丹参、乌梢蛇、麝香、马钱子、骨碎补、僵蚕、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味药材制成，具有活血化瘀、抗栓通脉之功效；一般用于血栓闭塞性脉管炎瘀血阻络证，常用于辅助治疗脑血栓、心肌梗死、血栓性静脉炎等疾病[1-3]。

目前抗栓胶囊的质量研究主要是针对当归尾、丹参和甘草等药材的薄层色谱鉴别及丹参酮ⅡA、士的宁等标志成分的含量测定，而安全性探索相对较少[1-3]。抗栓胶囊中含有土鳖虫生药粉末，关于土鳖虫黄曲霉毒素超标的现象时有报道[4-5]。中药外源性有害物质黄曲霉毒素的检测和控制是药品质量控制的重中之重[6]，目前该药仍未进行过黄曲霉毒素的安全性评估。

黄曲霉毒素（AFT）是公认的超级毒性致癌物，其种类较多，黄曲霉毒素的种类主要有黄曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1）和M2（AFM2）等，其中AFB1毒性最强，中药制剂主要涉及AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[5-7]。本文采用免疫亲和柱净化高效液相色谱柱后衍生荧光法（HPLC-FLD）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS）测定抗栓胶囊中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的残留量。两种检测方法互相验证，排除干扰，在符合《中国药典》2020年版要求的前提下，完善检测方法[7]。通过测定抗栓胶囊样品中黄曲霉毒素的残留量，为该药的质量控制和监管提供参考。

1 仪器与试药

LC-20A 高效液相色谱仪、RF-20AXS 荧光检测器（日本岛津有限公司）；光化学衍生器（美国AURA）；LCMS-8060 高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津）；XP504 电子天平（万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；IKA T25 分散机[艾卡（广州）仪器设备有限公司]；Thermo Scientific Multifuge X4R Pro 台式冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。黄曲霉毒素混合对照品（中国食品药品检定研究院，批号：610001-202107：AFB1以 1.08 µg·mL－1计算；AFB2以 0.33µg·mL－1计算；AFG1以 1.01 µg·mL－1计算；AFG2以0.30 µg·mL－1计算]。4 种不同品牌3 mL规格的免疫亲和柱[厂家分别为VICAM（维康）、ROMER、华安麦科和青岛普瑞邦（Pribolab）]，甲醇、乙腈和乙酸铵均为色谱纯，水为去离子水，氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾和吐温20 均为分析纯。抗栓胶囊样品来自全国20 个省级行政区，涉及9 家生产企业（编号A～I），共29批次样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[7-10]

2.1.1 HPLC-FLD 色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（16∶16∶68）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：40℃；柱后光化学衍生法：光化学衍生器（254 nm）；检测器：荧光检测器，激发波长λex：360 nm，发射波长λem：450 nm。

2.1.2 LC-MS 色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相：10 mmol·L－1醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；流速：0.3 mL·min－1，梯度洗脱（0～4.5 min，65%→15%A；4.5～6 min，15%→0%A；6～6.5 min，0%→65%A；6.6～10 min，65%A）；柱温：25℃；进样量：5 μL。

离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子源接口温度：300℃；脱溶剂温度：526℃；DL 管温度：250 ℃；载气流速：2 L·min－1；加热器流量：10 L·min－1；加热块温度：400℃；干燥气流速：10 L·min－1；采集模式为正离子模式；各化合物监测离子对和碰撞电压（CE）见表1。

表1 监测离子对、碰撞电压Tab 1 Monitor ion pair and collision voltage

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。

HPLC-FLD 对照品溶液：精密量取上述对照储备液1 mL，置25 mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得。

LC-MS 系列对照品溶液：精密量取对照储备液适量，用70%甲醇稀释成含AFB2、AFG2质量浓度为0.03～0.6 ng·mL－1，含AFB1、AFG1质量浓度为0.12～2 ng·mL－1的系列对照品溶液，见表2。

表2 系列混合对照品溶液质量浓度(ng·mL－1)Tab 2 Concentration of series mixed reference solution (ng·mL－1)

2.2.2 供试品溶液[7-8]取抗栓胶囊样品内容物粉末约5 g，精密称定，置于均质瓶中，精密加入70%乙腈溶液75 mL，高速搅拌2 min（11 000 r·min－1），4000 r·min－1离心5 min，精密量取上清液7 mL，置50 mL 量瓶中，用缓冲液（称取8.0 g 氯化钠、1.2 g 磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾、0.2 g 氯化钾，加水990 mL 使溶解，用盐酸调节pH 值至7.0，加水稀释至1000 mL，即可）稀释至刻度，摇匀，离心10 min，过滤（用玻璃纤维滤纸过滤），精密量取上清液20 mL，通过免疫亲和柱，流速3 mL·min－1，用10 mL 含1%吐温20 的水洗脱，再用20 mL 水洗脱，弃去洗脱液，再用1.5 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

2.3.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”项下HPLC-FLD 对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件进样5 μL；阴性样品（未检出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供试品溶液各进样20 μL 测定，黄曲霉毒素两个相邻色谱峰的分离度均大于1.5，典型色谱图见图1。

图1 阴性样品（A）、对照品（B）、供试品（C）的液相荧光色谱图Fig 1 Liquid phase fluorescence chromatogram of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.3.2 LC-MS 取表2中的3 号对照品溶液、阴性样品（未检出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供试品溶液按“2.1.2”项下色谱条件进样5 μL 测定，结果各峰形良好，响应高，试验条件满足测定要求，典型色谱图见图2。

图2 阴性样品（A）、对照品（B）、供试品（C）质谱MRM 的TIC色谱图Fig 2 TIC chromatogram of mass spectrometry MRM of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.4 线性关系考察

2.4.1 HPLC-FLD 分别精密吸取“2.2.1”项下HPLC-FLD 对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X，μL）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3。

2.4.2 LC-MS 分别精密吸取“2.2.1”项下LC-MS系列对照品溶液进样5 μL，测定峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标，进样质量浓度（X，ng·mL－1）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表3。

2.5 精密度试验

2.5.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”项下的HPLC-FLD对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 针，结果峰面积RSD，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面积RSD分别为1.2%、0.92%、0.75%和0.59%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 LC-MS 取表2中的3 号对照品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件连续进样6 针，计算峰面积RSD，结果AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面积RSD分别为6.9%、4.1%、5.1%和2.9%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取抗栓胶囊样品（生产企业F，批号：200510），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进行分析，HPLC-FLD 进样20 μL，LC-MS 进样5 μL，平行操作6 份。HPLC-FLD 法测得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分别为5.2%、5.3%、4.3%和4.1%；LC-MS 测得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分别为7.9%、5.9%、6.6%和5.9%，RSD均小于10%，表明本方法重复性良好，两种检测方法均可行。

2.7 检测限与定量限

2.7.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”项下HPLC-FLD对照品溶液稀释至一定的浓度，在 “2.1.1”项下色谱条件进样分析。以信噪比为10∶1 时相应浓度计算定量限，以信噪比为3∶1 时相应浓度计算检测限，定量限与检测限均折算到试样中被测物能被检测出的量，结果见表3。

2.7.2 LC-MS 取“2.2.1”项下LC-MS 系列对照品溶液中浓度最低的对照品溶液稀释至一定的浓度，在 “2.1.2”项下色谱条件进样分析。以信噪比为10∶1 时相应浓度计算定量限，以信噪比为3∶1 时相应浓度计算检测限，结果见表3。

表3 线性关系、检测限和定量限Tab 3 Linear，LOD and LOQ

2.8 稳定性试验

取抗栓胶囊样品（生产企业F，批号：200510），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。在0、2、4、6、10、12、16、24 h 时分别按“2.1”项下两种色谱条件进行分析，HPLC-FLD 进样20 μL，LC-MS进样5 μL，计算峰面积RSD。HPLC-FLD 法测得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面积的RSD分别为1.5%、0.83%、0.57%和0.56%；LC-MS 测得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面积的RSD分别为4.7%、3.3%、6.0%和2.0%，表明供试品溶液稳定性良好，检测方法可行。

2.9 加样回收试验

取抗栓胶囊空白样品（不含黄曲霉毒素）5 g，平行6 份，精密称定，精密加入对照储备液0.5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液后，分别按“2.1”项下两种色谱条件进行分析，HPLC-FLD进样20 μL，LC-MS 进样5 μL，结果HPLC-FLD法平均加样回收率（RSD）分别为AFG291.79%（1.3%）、AFG188.29%（2.1%）、AFB298.48%（1.3%）、AFB198.82%（1.1%）；LC-MS 法平均加样回收率（RSD）分别为AFG291.31%（5.8%）、AFG192.54%（4.1%）、AFB299.62%（4.4%）、AFB194.03%（2.8%），表明本试验准确度良好。

2.10 样品测定

取不同生产企业的抗栓胶囊样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用“2.1”项下色谱条件进行分析，HPLC-FLD 进样20 μL，LC-MS 进样5 μL，计算样品中4 种黄曲霉毒素的含量及其总量，结果见表4。部分超出线性范围的供试品溶液稀释后进样测定。

表4 样品测定结果(μg·kg－1)Tab 4 Sample determination results (μg·kg－1)

HPLC-FLD 和LC-MS 两种方法测定结果相对一致，其中液相色谱光化学衍生法HPLC-FLD 成本低，可成为生产企业质量控制方法的首选。《中国药典》2020年版中将LC-MS 作为黄曲霉毒素测定的验证结果，故以LC-MS 测定结果统计。AFG2的含量为0～28.946 μg·kg－1，AFG1的含量为0～496.11 μg·kg－1，AFB2的含量为0.029～37.751 μg·kg－1，AFB1的含量为1.115～481.879 μg·kg－1；4种黄曲霉毒素的总量为1.442～1044.686 μg·kg－1。29 批次样品中黄曲霉毒素检出率极高，其中AFB1检出率100%。《中国药典》2020年版中有关黄曲霉毒素的规定均为每1000 g 含AFB1不得过5 μg，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的总量不得过10 μg。参考此限度，按药典的数据修约规则，29 批次样品其中10 个批次样品AFB1超过5 μg，且AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的总量超过10 μg；1 批次样品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的总量超过10 μg。29 批次样品中黄曲霉毒素的不合格率为38%，其中一批次黄曲霉毒素残留量远超参考限度，安全风险相对较高。

3 讨论

3.1 测定方法的优化

本试验测定方法主要参考《中国药典》2020年版2351 真菌毒素测定法项下的黄曲霉毒素测定法，同时进行了部分优化。优化原因主要是抗栓胶囊基质复杂，预试验发现杂质对待测成分测定干扰较大。免疫亲和柱一般要求过柱的作业溶液pH 值为中性，抗栓胶囊初始提取液pH 值大约为5.3，整体偏酸性；过柱的作业溶液要求含甲醇量不超过20%，含乙腈不得过10%。作业溶液pH 值过低或者过高，含有机相过高均不利于免疫亲和柱吸附黄曲霉毒素。

前期试验考察了提取溶剂70%甲醇、80%甲醇、70%乙腈、80%乙腈和1%甲酸的70%甲醇的提取效果，发现70%乙腈提取效率最高。

考察测定量和取样量的影响：取混合好的抗栓胶囊内容物各5、10、15 g，比较样品中待测成分的含量，试验总体结果表明测定称样量为5 g 时，已经可以达到测定要求，但每盒样品中的内容物可能会出现不均匀现象。对比了取样10、50、100、200 g 的试验结果，建议每个批次样品内容物取样量不少于100 g。

选择市场上常见的4 种不同品牌的免疫亲和柱进行比较，结果表明不同品牌的亲和柱对测定影响较小，本试验方法兼容性良好。

3.2 建议与存在的不足

黄曲霉毒素毒性极强，目前大多不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，限量越低越好[10]。抗栓胶囊组方复杂，组方中有大量的原料药按《中国药典》2020年版需要进行黄曲霉毒素限量检查，限量检查的品种包括土鳖虫、蜈蚣、水蛭、蜂房、地龙、醋延胡索、制马钱子（药材及生马钱子饮片要求检验）和麸炒僵蚕（药材及僵蚕饮片要求检验）。

部分样品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量残留量极高原因跟生产企业的风险意识不强有关，客观原因是此次抽检的样品生产日期处于2020年版《中国药典》换版期间，生产企业原料药均按《中国药典》2015年版检验，这些高危品种大部分在2015年版药典均未要求进行黄曲霉毒素限量检查，存在一定的安全监控的漏洞。

为分析抗栓胶囊黄曲霉毒素含量过高的原因，对收到的生产企业B 和企业E 寄送的部分原料和小样进行了检测，发现生产企业B 提供的原料蜂房AFG2、AFG1、AFB2和AFB1残留量较高，严重超过了《中国药典》2020年版蜂房下的标准限度。遗憾的是未能获得黄曲霉毒素残留量较高样品相对应的原料药，生产企业寄送的部分原料不具有显著代表性，抗栓胶囊黄曲霉毒素污染的具体原因仍需进一步探究。课题组根据与相关生产企业沟通、日常相关饮片检验的数据和文献[9-12]推测抗栓胶囊黄曲霉毒素污染是上述多种高危原料饮片共同导致的结果，其中土鳖虫、醋延胡索和蜂房可能是最主要的源头，蜈蚣、水蛭、地龙、制马钱子和麸炒僵蚕可能是次要源头。

抗栓胶囊主要服用人群为老年人，黄曲霉毒素是中药外源性有害物质量控制的重中之重。基于上述试验结果，抗栓胶囊存在黄曲霉毒素污染的安全风险，课题组已向国家药品监督管理局建议增加抗栓胶囊的黄曲霉毒素限量检查，加大该药的安全监控；但此药的安全质量更需要相关企业加强黄曲霉毒素方面的质量控制的意识，严格把控原料的质量，保证用药安全。