基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术的二至丸入血入脑成分分析

林雪，薛傲，徐艳明，孙琪，徐红丹，，薛慧，杨波*，张宁，*（.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 50040；.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 54007）

二至丸由墨旱莲、女贞子两味药组成，具有补益肝肾、滋阴止血的功效。现代药理学研究表明，二至丸在抗衰老、益智等方面作用显著[1]，能够治疗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）[2]，但其发挥药效的活性成分尚未明确。UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术以其高分辨率、高质量精度的特点，在中药成分定性定量分析领域具有独特优势[3]。药物转运到作用部位才能发挥作用，吸收入血尤其入脑的成分可能是二至丸治疗AD 的潜在药效成分。目前对于二至丸入血入脑成分的研究相对较少，基于此，本实验运用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术对给予二至丸的D-半乳糖（D-gal）模型大鼠的体内成分进行分析，以期阐明二至丸治疗AD 的药效物质基础。

1 材料

1.1 仪器与试药

Dionex UltiMate 3000 戴安高效液相色谱仪，Q-Exactive Focus 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技公司）；Bionoon-VAC1型真空浓缩仪（上海般诺生物科技有限公司）；Mikro 200R 型离心机（德国 Hettich 公司）。女贞子（酒）、墨旱莲[北京同仁堂，经黑龙江中医药大学陈效忠副教授鉴定符合2020年版《中国药典》要求]。HPLC 级甲醇（美国Dikma 公司）；HPLC 级乙腈（美国Fisher 公司）；HPLC 级甲酸（美国Tedia 公司）。D-gal（上海吉至生化科技有限公司，批号：D96420，纯度99%）。红景天苷（批号：B20504）、特女贞苷（批号：B21240）、木犀草素（批号：A0108）、蟛蜞菊内酯（批号：B20934）、芹菜素（批号：B20981）、齐墩果酸（批号：BP1026）（上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%）。

1.2 动物

SD 大鼠，雌性，SPF 级，12 只，210～250 g [黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证号SCXK（黑）2018-004]。

2 方法

2.1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 检测条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温35℃，流速0.3 mL·min－1，进样量5 μL，流动相为0.1%的甲酸-水（A 相）和0.1%的甲酸-乙腈（B 相），梯度洗脱（0～3.5 min，5%～15%B；3.5～6.5 min，15%～30%B；6.5～12.5 min，30%～70%B；12.5～18 min，70%～100%B）。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正、负离子检测模式；扫描范围m/z50～1500 Da；喷雾电压（＋）3.5 kV，（－）3.2 kV；离子传输管温度320℃，AUG 气体加热温度350℃；碰撞能量20、40、60 eV；鞘气40 psi，辅助气20 psi，吹扫气10 psi；RF 镜头振幅（s-lens）60；分辨率一级高分辨质谱70 000 FWHM，二级高分辨质谱17 500 FWHM；动态排除时间5 s。

2.2 二至丸样品及体外对照品溶液的制备

女贞子（酒）、墨旱莲1∶1 比例混合，加入10 倍量的水，煎煮2 h，收集滤液，残渣加等量水继续煎煮1 h，过滤后合并滤液，浓缩成1 g·mL－1（以生药量计）的药液。取上述药液适量加70%的甲醇溶液稀释10 倍，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得二至丸样品溶液。

精密称定红景天苷、特女贞苷、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素、齐墩果酸对照品各1 mg于量瓶中，以70%甲醇稀释10 倍，配成0.1 mg·mL－1的对照品溶液，过0.22 µm 微孔滤膜，即得体外对照品溶液。

2.3 血液、脑脊液样品的采集和前处理

SD 大鼠适应性饲养7 d，按体质量随机分为模型组、空白组，每组6 只，连续4 周模型组腹腔注射D-gal 250 mg/（kg·d），空白组腹腔注射等量的生理盐水。实验前禁食12 h，正常饮水，模型组灌胃给予二至丸药液4.86 g·kg－1，给药后60 min，微量乙醚麻醉，眼底静脉丛取血，置于肝素化离心管中，3000 r·min－1离心10 min，取上清置－80 ℃冰箱保存。取血后，固定大鼠头部，75%乙醇对颈后部皮肤消毒，微量输液针从枕骨大孔刺入小脑延髓池，抽取脑脊液于预冷的离心管中，3000 r·min－1离心10 min，取上层脑脊液，－80℃冰箱保存。

取空白血浆和含药血浆各500 µL 于离心管中，加入2 mL 甲醇，30 µL 乙酸溶液涡旋混合1 min，超声1 min，13 000 r·min－1离心10 min，取上清液，真空浓缩离心仪1500 r·min－1、40 ℃浓缩至干燥，用150 µL 70%甲醇溶液复溶，过0.22 µm 微孔滤膜，即得血浆待测样品溶液。取空白脑脊液和含药脑脊液各200 µL 于离心管中，加入800 µL 甲醇，涡旋混合1 min，超声1 min，13 000 r·min－1离心5 min，取上清液，真空浓缩离心仪1500 r·min－1、40 ℃浓缩至干燥，用60 µL 70%甲醇溶液复溶，过0.22 µm 微孔滤膜，即得脑脊液待测样品溶液。

2.4 二至丸成分数据库的建立及数据处理

在TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）、TCMSP（http://www.tcmsp-e.com/）等中药成分数据库中检索二至丸及其单味药成分结合相关文献补充，对二至丸的化学成分信息进行整合汇总建立成分数据库。数据处理采用Xcalibur 软件，通过分析保留时间、精确分子质量、元素组成、同位素丰度和一级质谱图、二级质谱图，结合二至丸成分数据库、Pubchem 数据库、对照品和相关文献，对化学成分进行辨识分析。

3 结果

3.1 二至丸入血入脑原形化合物的鉴定

应用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术，在正、负离子模式下，对二至丸样品溶液、大鼠血浆和脑脊液中的成分进行检测，结果二至丸样品溶液、血浆和脑脊液总离子流图见图1。共发现原形入血成分25 种，原形入脑成分3 种，见表1。

表1 二至丸原形入血、入脑原形化合物信息表Tab 1 Information of prototype blood and brain compounds of Erzhi pills

图1 正、负离子模式下二至丸TIC 图Fig 1 TIC for Erzhi pills in both positive and negative ion modes

3.2 二至丸入血入脑原形成分解析

3.2.1 黄酮类化合物 黄酮类化合物结构与雌激素相似，A、B 环上常被甲基、甲氧基等基团取代。在质谱的高强度碰撞过程中，RDA 裂解。CO、CO2等中性分子的丢失是黄酮类化合物的主要裂解特征[20]。实验中从二至丸给药血浆中鉴别出黄酮类成分8 个，包括化合物3（20）、4（23）、5（26）、6（28）、7（29）、15、18、24；从给药脑脊液中鉴别出黄酮类成分1 个，为化合物5（26）。以化合物26（5）和化合物28（6）为例来说明黄酮类化合物的鉴定过程。化合物26（5）保留时间8.52 min，准分子离子峰m/z285.0401 [M-H]－，软件推测分子式为C15H10O6，主要碎片离子包括m/z151.00 和m/z133.03，是准分子离子峰m/z285.04通过黄酮类化合物的特征性裂解方式RDA 裂解得到的。与文献报道[9]基本一致，故将其鉴定为木犀草素，二级碎片离子和可能的裂解途径见图2。化合物28（6）保留时间为9.26 min，准分子离子峰m/z269.0452 [M-H]－，软件推测分子式为C15H10O5，主要碎片离子包括m/z225.06、201.06、181.06、159.04、117.03 等，其中m/z225.06 是准分子离子峰失去一个中性的CO2分子所得，进而再失去一个CO2得到m/z181.06 碎片离子。m/z201.06 离子是准分子离子峰丢失C3O2后经氢重排所得，但其结构不稳定易丢失C2H2O 形成稳定的具有共轭结构的离子m/z159.04，m/z159.04 又可丢失C2H2O 生成碎片离子m/z117.03，碎片信息与文献报道[9]基本一致，故将其鉴定为芹菜素，二级碎片离子和可能的裂解途径见图3。

图2 木犀草素二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 2 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of luteolin

图3 芹菜素二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 3 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of apigenin

3.2.2 香豆素类化合物 香豆素类化合物结构与雌二醇相似，结构中的内酯和呋喃骨架容易发生CO2和CO 的中性丢失[17]。从二至丸给药血浆中鉴别出香豆素类成分2 个，即化合物22 和27；从给药脑脊液中鉴别出香豆素类成分1 个，为化合物27。以化合物27 为例，说明香豆素类化合物的鉴定过程。化合物27 保留时间为8.78 min，软件得到准分子离子峰为m/z313.0351[M-H]－，推测分子式为C16H10O7，质谱扫描获得碎片离子m/z298.01、270.02、254.02 等，分别是准分子离子峰依次丢失CH3、CO、CO2所得，与文献报道[17]基本一致，故将其鉴定为蟛蜞菊内酯，二级碎片离子和可能的裂解途径见图4。

图4 蟛蜞菊内酯二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 4 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of wedelolactone

3.2.3 苯乙醇苷类化合物 苯乙醇苷是一类以取代苯乙醇为苷元的苷，其成苷的中心葡萄糖基常连有芳香酰基[10]。实验从二至丸给药血浆中鉴别出苯乙醇苷类化合物2 个，即化合物10 和11；从给药脑脊液中亦鉴别到化合物11。化合物11 保留时间为3.39 min，准分子离子峰为m/z299.1153 [M-H]－，软件推测分子式为C14H20O7，质谱扫描得到碎片离子m/z179.05 和m/z119.05，分别为葡萄糖基碎片和酪醇-OH 的碎片离子，与文献报道[10]基本一致，故鉴定其为红景天苷，二级碎片离子和可能的裂解途径见图5。

图5 红景天苷二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 5 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of salidroside

3.2.4 萜类化合物解析 萜类以异戊二烯单位（C5单位）为基本骨架[8]，根据分子中C5单位的数量分为单萜、二萜、三萜等，在二至丸给药血浆中共鉴别出萜类化合物3 种，即化合物1、8（30）、31。以化合物30 为例，说明萜类化合物的鉴定过程。化合物30 保留时间为16.45 min，准分子离子峰m/z455.3531 [M-H]－，软件推测分子式为C30H48O3，m/z391.23 是准分子离子峰失去一分子H2O 和HCOOH 得到的离子碎片，与文献报道[8]基本一致，故将其鉴定为齐墩果酸，二级碎片离子和可能的裂解途径见图6。

图6 齐墩果酸二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 6 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of oleanolic acid

3.2.5 裂环环烯醚萜类化合物 环戊并吡喃是裂环环烯醚萜类化合物的特征结构，在质谱碰撞过程中该结构的键会发生断裂。裂环环烯醚萜类化合物侧链上的官能团也常以CH3OH、H2O、CO2和糖分子的形式丢失[9]。在二至丸给药血浆中共鉴别出裂环环烯醚萜类化合物3 种，即化合物16、19、21。化合物21 保留时间为7.03 min，准分子离子峰为m/z685.5621 [M-H]－，推测其分子式为C31H42O17，质谱扫描获得主要离子碎片包括m/z523.18、453.14、421.15 等。准分子离子峰失去一分子C4H6O 产生m/z453.14 碎片，再失去一分子CH3OH 得到m/z421.15 碎片，m/z453.14、m/z421.15 及分子离子峰失去一分子葡萄糖得到的m/z523.18 碎片都是裂环环烯醚萜类裂解的典型片段。与文献报道[9]基本一致，故将其鉴定为特女贞苷，二级碎片离子和可能的裂解途径见图7。

图7 特女贞苷二级碎片离子和可能的裂解途径Fig 7 Secondary fragment ion and possible cleavage pathways of nuezhenide

4 讨论

多成分、多靶点是二至丸复方体系的重要特点，也给二至丸治疗AD 的药效物质基础研究带来了挑战。经典复方体系研究往往以体外成分为研究对象[13]，血浆等内环境对中药复方成分的影响就很容易被忽视。因此，实验采用具有较强分离、检测能力的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术对二至丸的入血入脑成分进行检测。二至丸成分复杂多样，在血浆和脑脊液的复杂体系影响下更容易发生改变，为了最大程度获取样品中化合物的质谱信息，实验采用了正、负两种离子化采集模式。结果在给药血浆中鉴定出黄酮类、香豆素类、苯乙醇苷类、三萜类等多种类型的成分，研究发现黄酮类成分木犀草素和芹菜素都具有促进神经元修复和再生的神经保护作用[21-22]。香豆素类成分蟛蜞菊内酯具有调节氧化应激和线粒体功能障碍从而保护神经退行性病变的作用[23]。苯乙醇苷类成分红景天苷对大脑神经可塑性的调节作用也不容忽视，神经元突触的活性依赖降低能够被其抑制[24]。Guo 等[25]研究发现三萜类成分齐墩果酸能够调节亚锡钙蛋白-1 和解偶联蛋白-2信号而缓解AD 中的氧化应激和Aβ沉积。Zhang等[26]研究发现裂环环烯醚萜类成分栀子苷能够下调mTOR 信号，使Aβ纤维的自噬和溶酶体清除增强。酚酸类成分原儿茶酸和咖啡酸也被证实具有改善神经炎症[27]，减少Aβ聚集[28]，进而改善AD 学习记忆障碍的药理作用。此外，在给药脑脊液中还鉴定出木犀草素、红景天苷、蟛蜞菊内酯3 种成分，提示它们对改善D-gal 模型大鼠学习记忆障碍的过程中的贡献可能更大。

目前，关于二至丸发挥改善D-gal 模型大鼠学习记忆障碍的具体作用机制和代谢途径研究还不明确，在后续研究中，作者将进一步考察这些入血尤其是入脑成分的生物活性和代谢途径，并进行血液和脑脊液的药动学监测，明确具体的量效关系，为更好地阐明体二至丸治疗AD 的体内药效物质和作用机制提供实验依据。