木榄胚轴总黄酮通过调节PI3K/Akt信号通路诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡

陈美先，卓清缘，柴民伟，王健松，王羚郦*（.广州中医药大学 中药学院，广州 50006；.北京大学深圳研究生院环境与能源学院，广东 深圳 58055）

据世界卫生组织统计，2020年结直肠癌在全球的发病率排第三，病死率排第二[1]。目前西医治疗肿瘤以手术、放化疗、分子靶向、内分泌治疗及一些新辅助治疗等综合治疗为主[2-3]，但因其毒副作用大且预后差而具有一定的局限性。因此，在植物中寻找天然抗肿瘤活性物质一直是抗肿瘤药物研究的热点。

木榄（Bruguiera gymnorrhiza）是红树科木榄属植物，是一种传统海洋药用植物，已被《中国药用植物志》《海洋药物》《现代本草纲目》等中草药专著收载。据记载，木榄的叶、胚轴、树皮等部位均可入药，主要功效有清热解毒、止泻、消炎、收敛、止血、截疟等[4-6]。目前已有研究表明木榄胚轴中的一些化合物具有体外抑制肺癌细胞增殖的作用[7]，但对其他肿瘤细胞是否具有生长抑制作用，未见相关报道，抗肿瘤的分子机制也尚未完全阐明。

细胞周期和细胞凋亡在人类组织的正常发育和平衡中发挥着重要作用，同时也与许多疾病状态有关，包括癌症[8]。中药总黄酮提取物是一类潜在的抗肿瘤有效成分[9-11]。在前期研究中初步发现了木榄胚轴的总黄酮（total flavoniods fromBruguiera gymnorrhizahypocotyls，TFBH） 成分具有体外抗结肠癌活性。因此，本研究从木榄胚轴中提取、富集了总黄酮成分，首次探究TFBH对人结肠癌HT-29 细胞增殖和迁移的影响，并结合细胞周期和细胞凋亡共同探究其作用机制，为进一步阐明木榄胚轴的抗肿瘤活性及其作用机制提供参考和依据。

1 材料

1.1 细胞株

人结肠癌细胞株HT-29（武汉普诺赛生命科技有限公司）。采用含10%胎牛血清和含1%双抗生素的McCoy’s 5A 培养基培养细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。

1.2 试药

TFBH：用10 倍量的70%乙醇在室温下超声提取1.0 kg 木榄胚轴干燥粉末，过滤后将提取液旋转蒸发浓缩，用适量的水将浓缩后的浸膏溶解，于D101 大孔树脂上分离，分离条件为50%乙醇，低温浓缩干燥后用二甲基亚砜（DMSO）制备成125 μg·μL－1的储备液，置于4℃密封保存；以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[12]测定TFBH 的总黄酮含量为83.02%。所用植物部位于2021年采于深圳福田红树林保护区，经北京大学环境与能源学院柴民伟教授鉴定。

McCoy’s 5A 培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；双抗生素（美国Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（德国PAN-Biotech 公司）；芦丁（HPLC ≥98%）、D101 大孔吸附树脂（上海源叶生物科技有限公司）；MTT（德国BioFroxx 公司）；DMSO（MP Biomedicals LLC.）；Hoechst 33258、Tris-甘氨酸-SDS-电泳缓冲液（Biosharp 生物科技有限公司）；细胞周期试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海贝博生物公司）；RIPA 裂解液、蛋白上样缓冲液（5×）、无蛋白快速封闭液（5×）（上海雅酶生物科技有限公司）；无蛋白快速转膜液（20×）（苏州新赛美生物科技有限公司）；胰酶消化液、蛋白marker（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；PVDF 膜（美国Millipore 公司）；ECL 化学发光液、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗体、HRP 标记山羊抗兔IgG 二抗（Affinity Biosciences LTD）。

1.3 仪器

多功能酶标仪（型号Multiskan GO，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；BD LSRFortessa 流式细胞仪（美国BD 公司）；荧光显微镜[型号BX53，奥林巴斯（中国）有限公司]；SDS-PAGE 电泳仪[型号EP300，韦克斯（北京）科技有限公司]；全自动化学曝光分析系统（型号COMPLEX2000，Bioworld 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法检测细胞增殖情况

取对数生长期的HT-29 细胞以合适的细胞密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中贴壁培养24 h。弃去原培养基并加入含0.2%DMSO 的培养基和不同质量浓度TFBH（25、50、100、200、250 μg·mL－1）的含药培养基，每组6 个复孔，继续培养12 h、24 h 和48 h，倒置显微镜下观察细胞的形态变化后，每孔加入20 μL MTT（PBS 稀释至 5 mg·mL－1），置于恒温箱中继续培养4 h。4 h 后吸弃上清，每孔加150 μL 的DMSO 以溶解由活细胞代谢产生的甲瓒产物，摇床上震荡10 min，用多功能酶标仪在570 nm 波长处检测各孔的吸光度（A）。使用GraphPad 软件计算细胞增殖抑制率及IC50值。

2.2 划痕实验

将HT-29 细胞以合适密度接种于6 孔板中，置于培养箱中培养，待细胞密度至90%左右，使用直尺和200 μL 枪头在每个孔中进行轻微的直线划痕，用PBS 清洗细胞碎片。根据给药浓度分为3 组，以接近1 倍IC50值作为高剂量组（62.5 μg·mL－1），以接近4/5 倍IC50值作为中剂量组（50 μg·mL－1），以接近3/5 倍IC50值作为低剂量组（37.5 μg·mL－1）。加入含有TFBH 药物（37.5、50、62.5 μg·mL－1）的完全培养基2 mL，对照组加入等体积的培养基，在显微镜下进行拍照，记录细胞0 h、24 h 的迁移距离，用Image J软件分析迁移能力，计算HT-29 细胞的迁移率。

2.3 流式细胞术检测细胞周期

取对数生长期的HT-29 细胞消化并计数，接种于6 孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。加入质量浓度分别为37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，对照组加入等体积的培养基，每组设3 个复孔，处理细胞24 h。胰酶消化细胞，计数，离心。用500 μL PBS 重悬细胞，缓慢滴加2 mL 预冷的无水乙醇固定细胞，4℃放置过夜。根据细胞周期试剂盒步骤进行染色，流式细胞仪检测结果。每组实验重复3 次，Modfit 软件分析细胞生长各期的所占比例。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

选取生长状态良好的HT-29 细胞消化并计数，接种于6 孔板中，接种密度5×106个/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。加入质量浓度分别为37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，对照组加入等体积的培养基。作用24 h后使用无EDTA 的胰酶消化并收集细胞。按照Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒说明书操作细胞染色，流式细胞仪分析结果。每组实验重复3次，Flow Jo V10 软件分析Annexin V-FITC 阳性细胞所占比例，即细胞凋亡率。

2.5 Hoechst 33258 染色观察细胞凋亡

取对数生长期的HT-29 细胞，调整密度为1×105个·mL－1的细胞悬液。将制备好的细胞悬液接种于加入细胞爬片的12 孔板，每孔1 mL，轻微晃动，使细胞均匀铺在爬片上。24 h 后弃去原培养液，加入1 mL 质量浓度分别为37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，对照组加入等体积的培养基，培养24 h。吸弃培养液，PBS 漂洗1 min×2 次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3 min×2 次；每孔加入Hoechst 33258 染色剂30 μL，室温条件下避光染色10 min。染色完毕，PBS 漂洗3 min×2 次。在紫外光340 nm 的波长处激发，显微镜下观察不同组别的荧光强度情况。

2.6 Western blot

取对数生长期的HT-29 细胞，接种于6 孔板中，接种密度5×106个/孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。加入质量浓度分别为37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，对照组加入等体积的培养基，处理24 h 后提取细胞总蛋白。将细胞置于冰上，加入RIPA 裂解液裂解30 min，12 000 r·min－1、4℃离心10 min。取上清液分装于1.5 mL 离心管中，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性后于－80℃保存。蛋白上样后SDSPAGE 电泳，快速转膜，转膜后快速封闭10 min；孵育一抗，4℃放置过夜，TBST 清洗10 min×3次；二抗室温孵育1.5 h，TBST 清洗10 min×3次；ECL 化学发光，于全自动化学曝光分析系统内进行曝光，分析各组蛋白表达情况。

2.7 统计学分析

应用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、Image J 等软件对实验数据进行分析，每组实验重复3次，结果用均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，如满足方差齐性用LSD分析，若不满足方差齐性则用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 TFBH 对HT-29 细胞增殖能力的影响

结果显示，TFBH 对HT-29 细胞有生长抑制作用，呈时间和浓度依赖关系（见图1）。TFBH作用于结肠癌HT-29 细胞12 h、24 h 和48 h 后的IC50值分别为（307.80±4.28）、（178.30±7.00）、（63.37±8.42）μg·mL－1，可见TFBH 对HT-29 细胞增殖抑制的最佳时间为48 h。在光学显微镜下观察TFBH 作用HT-29 细胞48 h 后的细胞形态，结果显示随着给药浓度增大，细胞界限模糊，细胞皱缩变小的程度逐渐加深，见图1。

图1 TFBH 对HT-29 细胞增殖的影响（×100）Fig 1 Effect of TFBH on the proliferation of HT-29 cells（×100）

3.2 TFBH 对HT-29 细胞迁移率的影响

利用划痕实验检测TFBH 是否抑制HT-29 细胞发生迁移，结果见图2，细胞迁移率随TFBH给药浓度的增加而降低。与对照组比较，50、62.5 μg·mL－1TFBH 组的细胞迁移率差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001），可见TFBH 能够抑制HT-29 细胞发生迁移。

图2 TFBH 对HT-29 细胞迁移的抑制作用（×40）Fig 2 Inhibitory effect of TFBH on HT-29 cell migration（×40）

3.3 TFBH 对HT-29 细胞周期的影响

TFBH 对HT-29 细胞周期中各个时期所占比例的影响见图3。结果显示，与对照组相比，TFBH 给药组的G0/G1期和G2/M 期的比例呈上升趋势，S 期的比例呈下降趋势，其中TFBH 62.5 μg·mL－1组的G0/G1期、S 期和G2/M 期与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。以上结果说明，TFBH 可诱导HT-29细胞周期发生G0/G1期和G2/M 期阻滞。

图3 TFBH 对HT-29 细胞周期的影响Fig 3 Effect of TFBH on cell cycle of HT-29 cells

3.4 TFBH 对HT-29 细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI 双染法检测结果如图4所示。TFBH 给药组均可诱导HT-29 细胞发生不同程度的凋亡。与对照组比较，TFBH 各给药组的凋亡率差异有统计学意义（P＜0.001）。

图4 TFBH 对结肠癌HT-29 细胞凋亡的影响Fig 4 Effect of TFBH on apoptosis of HT-29 cells

3.5 TFBH 对细胞凋亡形态的影响

Hoechst 33258 染色后在荧光显微镜下可观察到活细胞细胞核呈弥散均匀的弱蓝色荧光，凋亡细胞核可见致密浓染的亮蓝色荧光。结果显示，对照组细胞核形态较为一致，显弱蓝色荧光。与对照组相比，TFBH 各给药组处理细胞后，均能观察到亮蓝色荧光的细胞核数量有所增加（见图5），各组凋亡细胞核的荧光强度与TFBH 给药浓度成正相关。

图5 TFBH 对HT-29 细胞凋亡形态学的影响（×200，×400）Fig 5 Effect of TFBH on morphological features of apoptosis of HT-29 cells（×200，×400）

3.6 TFBH 对凋亡相关蛋白表达的影响

如图6所示，TFBH 各给药组作用HT-29 细胞24 h 后，凋亡相关蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表达均有上调趋势，Bcl-2 蛋白表达下调，并且存在浓度依赖性。与对照组相比，TFBH 各给药组的cleaved caspase-3/caspase-3 以及50、62.5 μg·mL－1TFBH 组的Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9 相对蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

图6 TFBH 对细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响Fig 6 Effect of TFBH on the expression levels of cell apoptosis related proteins

3.7 TFBH 对PI3K/Akt 信号通路蛋白的影响

通过检测PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平探究其是否参与TFBH 对细胞凋亡的影响，结果如图7所示。与对照组相比，TFBH 处理24 h后，该通路关键蛋白p-PI3K 和p-Akt 的表达量显著降低，TFBH 各给药组的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 相对蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）。

图7 TFBH 对PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平的影响Fig 7 Effect of TFBH on the expression levels of related proteins in the PI3K/Akt signaling pathway

4 讨论

4.1 实验方法分析

MTT 实验证明TFBH 抑制HT-29 细胞增殖的最佳时间为48 h，而本研究在其他实验中的药物处理时间为24 h 的原因是，在实验过程中，当给药处理时间为48 h 时，6 孔板中的中、高剂量组的贴壁细胞出现大片脱落，悬浮在培养液中，这种情况对细胞凋亡指标的检测会产生较大的影响和误差；而当处理时间为24 h 时，贴壁细胞发生脱落的情况较少、程度较轻，综合流式细胞实验的结果可以看出，给药处理24 h 后，低、中、高剂量组的凋亡率与对照组间有明显的差异，所以统一将给药处理时间定为24 h。

4.2 实验结果分析

本研究从细胞周期、细胞凋亡表型实验评价TFBH 抑制HT-29 细胞增殖和迁移的主要作用。从实验结果来看，TFBH 能明显抑制HT-29 细胞增殖，但抑制HT-29 细胞的迁移能力相对较弱。TFBH 可以阻滞HT-29 细胞周期中的G0/G1期和G2/M 期，但仅高剂量组的作用效果较为明显。本研究中的Hoechst 33258 细胞核染色和流式细胞术实验共同证明了TFBH 各剂量组均可诱导HT-29 细胞发生凋亡，并且提示在给药时间为24 h 时，TFBH 主要诱导HT-29 细胞发生早期凋亡。以上结果表明，TFBH 诱导HT-29 细胞发生凋亡比阻滞其细胞周期的作用更为明显。因此，本研究中机制探究的重点在于TFBH 如何诱导HT-29细胞发生凋亡。

4.3 机制研究

PI3K/Akt 信号通路作为一个关键的信号转导通路，在控制细胞生长、增殖和凋亡中扮演着重要的角色。PI3K 激活后可以通过磷酸化Akt的thr308 位点激活Akt[13]。磷酸化Akt 通过调节Bcl-2 蛋白家族来控制细胞凋亡[14]。活化的Akt 可以磷酸化Bad 蛋白的ser136 位点，导致Bcl-2 的释放，与Bax 结合形成二聚体，或者磷酸化Bax 蛋白的ser184 位点，与Bcl-2 结合形成二聚体。因此，上述两种由Akt 引起的Bcl-2 蛋白家族的磷酸化方式都可以起到抑制凋亡的作用[15-16]。另一方面，细胞凋亡是一种自主细胞程序性死亡，受外源途径和内源途径控制，其中涉及线粒体的内源途径是细胞凋亡的重要途径之一[17]。Bcl-2 蛋白家族与线粒体凋亡途径密切相关，是改变线粒体内膜通透性的重要调控因子，称为线粒体通透性转换孔[18]。根据细胞凋亡过程中不同的功能，Bcl-2 蛋白家族可分为促进细胞凋亡的Bax 蛋白亚家族和抑制细胞凋亡的Bcl-2蛋白亚家族[19]，通过调节促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比例，特别是Bax/Bcl-2 的比例，可以促进或抑制凋亡。本研究表明，TFBH 可通过上调Bax/Bcl-2 的比例从而促进凋亡。

Caspase 是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。当Bcl-2 蛋白家族诱发线粒体凋亡时，线粒体受损释放细胞色素C，pro caspase-9 可以和细胞色素C 以及Apaf1 形成复合物，同时被激活。激活的caspase-9（cleaved caspase-9）可以激活细胞凋亡的关键酶caspase-3，进一步激活后续的细胞凋亡信号[20]。Caspase-3 是细胞凋亡过程中最关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，例如PARP。Caspase-3 的激活需要从没有活性的全长caspase-3，在asp28 和ser29 之间及asp175 和ser176 之间进行剪切，产生有活性的cleaved caspase-3。因此caspase-3 的激活常被作为细胞凋亡的一个重要指标[21]。本研究结果显示，TFBH 各给药组中的cleaved caspase-9/caspase-9、cleaved caspase-3/caspase-3 相对蛋白表达上升，说明TFBH 很可能是通过caspase 级联反应激活caspase-9，然后激活caspase-3，从而促进细胞凋亡。

4.4 总结

本研究发现，TFBH 可以在体外抑制人结肠癌HT-29 细胞的增殖和迁移。TFBH 能通过阻滞HT-29 细胞周期的G0/G1期和G2/M 期以及诱导HT-29 发生凋亡抑制细胞生长。TFBH 诱导细胞凋亡的作用机制与抑制PI3K/Akt 信号通路有关，通过上调Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9以及cleaved caspase-3/caspase-3 的表达激活线粒体内源性凋亡途径并进一步激活caspase 级联反应，诱发细胞凋亡。但本研究并未考察TFBH 对HT-29 细胞侵袭的作用，也没有深入探究TFBH阻滞细胞周期的作用机制，这将成为今后研究的方向。另有研究表明，PI3K/Akt 与mTOR 蛋白的关系密切，PI3K/Akt/mTOR 通路同样可以调控细胞凋亡，甚至是细胞自噬[22-25]。因此在今后的研究中，还可结合相关实验证明TFBH 在抑制肿瘤生长过程中是否促进或抑制细胞发生自噬。