补阳还五汤治疗阿尔茨海默病的网络药理学研究及实验验证

李金尧，王雅梦，雷霞，赵晨宇，董晓红，刘国良，张宁，*，刘斌*（.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 50040；.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 54007）

补阳还五汤（BYHWD）为传统中药方剂，由生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、地龙、桃仁、红花组成，具有补气养血、通经活络的作用，临床上常用于治疗血管性痴呆、动脉粥样硬化等心脑血管疾病[1-2]。有研究表明，BYHWD 对阿尔茨海默病（AD）也具有良好的治疗效果，但其作用机制尚不明确[3-4]。网络药理学以生物数据库及组学实验数据为基础，融合多学科原理和技术，可以预测参与机体生物学过程的作用靶点和通路途径，为揭示中医药疗效的多靶点机制研究提供新的方法和思路[5]。Qu 等[6]发现黄芪甲苷可以降低血脑屏障（BBB）的通透性，减少外周有毒物质进入大脑，保护神经元。因此推测BYHWD 的神经保护作用可能与BBB 有关，通过网络药理学预测BYHWD 治疗AD 的作用机制，并用动物实验对网络药理学结果进行验证，探讨BYHWD如何达到治疗AD 的效果。

1 材料

1.1 仪器与试药

新物体识别设备（货号：RD1121-NR-M）、避暗设备（货号：RD1106-SB-M）（上海移数）；光学显微镜（货号：IX-71-21PH，奥林巴斯）；转轮式切片机（货号：RM2016，德国LEICA）。苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（货号：C0105S，碧云天生物技术）；兔抗-晚期糖基化终末产物受体（RAGE）多克隆抗体（货号：125422）、兔抗-低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）多克隆抗体（货号：124368）、兔抗-血管内皮细胞黏附分子1（VCAM-1）多克隆抗体（货号：11989）、兔抗-载脂蛋白E（ApoE）多克隆抗体（货号：119748）（爱必信）；辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（货号：PV-6001，中杉金桥）；山羊血清（货号：SL038，北京Solarbio）；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（货号：W026，南京建成）；盐酸多奈哌齐（货号：S60449，源叶生物）；生黄芪、当归尾、赤芍、川芎、地龙、桃仁、红花均购自黑龙江中医药大学附属第一医院，由黑龙江中医药大学实验中心田明教授鉴定生黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 的干燥根，当归尾为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHor 的干燥根茎，地龙为巨蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥体，桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 的干燥成熟种子，红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。取生黄芪1200 g、当归尾60 g、赤芍45 g、川芎30 g、地龙30 g、桃仁30 g、红花30 g 制备成BYHWD 水煎剂，经冷冻干燥制为干粉，出粉率是34.11%，得到干粉486 g，于4℃冰箱密封保存备用。

1.2 实验动物

APP/PS1 双转基因小鼠和SPF 级C57BL/6J小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2015-0001 号]，雄性，7月龄，体质量为（40±10）g。于无菌环境饲养，温度保持在（21±1）℃，相对湿度（60±10）%，动物自由饮水进食。

1.3 数据库及软件

TCMSP 数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），HERB 数据库（http：//herb.ac.cn/），UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），SwissADME数据库（http：//www.swissadme.ch/），SwissTarget-Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/），OMIM 数据库（https：//www.omim.org/），DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/），HPO 数据 库（https：//hpo.jax.org/），STRING 11.5 数据库（https：//cn.string-db.org/），Metascape 数据库（https：//metascape.org/gp/index.html），Cytoscape 3.7.2 软件。

2 方法与结果

2.1 网络药理学

2.1.1 BYHWD 成分收集及靶点预测 运用TCMSP、HERB 数据库筛选黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花的化学成分信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为标准筛选有效成分和作用靶点。由于TCMSP 数据库未收录地龙，HERB 数据库相关化学成分信息较少，其化学成分信息通过文献检索获得，在SwissADME 平台以可透过BBB、胃肠道吸收活性高、“Druglikeness”项有两个及以上“Yes”为标准筛选有效成分，通过SwissTargetPrediction 平台预测其作用靶点，用UniProt 数据库校正为官方基因名。共收集到 BYHWD 活性成分118 个，其中黄芪20 个、当归2 个、赤芍29 个、川芎7 个、桃仁23 个、红花22 个、地龙15 个，删除重复值后得到744 个作用靶点。

2.1.2 AD 靶点预测 分别登录TTD、OMIM、DisGeNET、HPO 数据库，以“Alzheimer’s disease”为关键词搜索AD 的作用靶点，将四个数据库得到的靶点整合取交集，并用UniProt 数据库校正为官方基因名，最终整理出1607 个AD 作用靶点。

2.1.3 BYHWD 抗AD 潜在靶点的筛选 将BYHWD 的作用靶点和AD 作用靶点分别录进Venny 作图工具，取交集，得到163 个BYHWD抗AD 的潜在作用靶点，潜在作用靶点对应BYHWD 的89 个活性成分。

2.1.4 PPI 网络的构建 将潜在作用靶点上传至STRING 11.5 数据库，将蛋白种属设置为“Homo sapiens”，其余设置默认，进行 PPI 网络的构建和分析，利用Cytoscape 3.7.2 可视化处理，见图1。如图1所示，该交互网络中有163 个节点和2103个连线（颜色越深、节点越大表示连接度越高）。

图1 BYHWD 抗AD 作用靶点的PPI 网络Fig 1 PPI network of anti-AD targets of BYHWD

2.1.5 “组方药材-活性成分-疾病靶点”网络图的构建 运用Cytoscape 3.7.2 软件将7 个组方药材、89 个活性成分、163 个交集靶点构建组方药材-活性成分-疾病靶点网络图，见图2（颜色越深、节点越大表示节点越重要）。

图2 组方药材-活性成分-疾病靶点网络Fig 2 Medicinal material-active ingredient-disease target network

2.1.6 GO 及KEGG 富集分析 将潜在作用靶点输入Metascape 基因富集在线工具，限定物种为“Homo sapiens”，进行GO 及KEGG 富集分析，以P＜0.05 筛选排名前10 的信息作GO 柱状图和KEGG 气泡图，借助微生信平台将其可视化。GO 富集结果表示，生物过程主要涵盖激酶活性调节、蛋白质磷酸化正调节、细胞对氮化合物的反应、MAPK 级联调节等；细胞成分主要包括树突、树突树、突触后膜等；分子功能主要涉及蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶活性等（见图3）。KEGG 富集分析发现癌症、AD、胆固醇代谢、脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE 信号通路等与AD 密切相关（见图4）。

图3 GO 富集分析结果Fig 3 GO enrichment analysis

图4 KEGG 富集分析结果Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.2 动物实验

2.2.1 动物分组及给药 实验小鼠随机分为6 组，20 只C57BL/6J 小鼠作为对照组，APP/PS1 双转基因小鼠按照每组20 只，随机分为模型组，阳性药多奈哌齐组，BYHWD 高剂量、中剂量和低剂量组。模型组和对照组每日灌胃同样体积的生理盐水，多奈哌齐组小鼠灌胃0.001 g/（kg·d）剂量的多奈哌齐，BYHWD 高剂量、中剂量和低剂量组分别灌胃37.06、18.53、9.26 g/（kg·d）剂量的BYHWD（生药量），灌胃持续35 d。

2.2.2 新物体识别实验 将两个完全相同的物体放置在旷场箱内，距离为25 cm，放入小鼠让其自由探索10 min，取出，将其中一个物体替换为不同颜色、形状和材质的新物体。让小鼠休息5 h后，再放在与上次一样的位置，自由移动10 min。记下对新鲜物体的探索时间（Tn）和熟悉物体的探索时间（Tf），用识别指数（Ti）[Ti＝Tn/（Tn＋Tf）×100%]表示小鼠对物体识别的能力，结果见表1。与对照组相比，模型组小鼠的新物体识别指数下降（P＜0.001）；与模型组相比，BYHWD各剂量组新物体识别指数上升（P＜0.001）。

表1 BYHWD 对APP/PS1 小鼠新物体识别实验的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表1 BYHWD 对APP/PS1 小鼠新物体识别实验的影响(±s，n＝10)Tab 1 Effect of BYHWD on novel object recognition experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

组别识别指数/%对照组37.59±2.15模型组14.94±2.29***多奈哌齐组29.73±1.89###BYHWD 高剂量组32.47±2.02###BYHWD 中剂量组31.39±1.78###BYHWD 低剂量组25.10±1.68###

2.2.3 避暗实验 训练前将小鼠背向洞口放置于明室，适应2 min 后，暗室通40 V 电流，记录下每只小鼠潜伏期（即小鼠第一次进入暗室的时间）。每次训练5 min，每日训练3 次，连续训练2 d 以改善小鼠的避暗行为。若小鼠在5 min 内没有入洞，则弃去。24 h 后开始测试，记录小鼠的避暗潜伏期和5 min 内的进入次数（即错误次数）。结果见表2。与对照组相比，模型组小鼠避暗潜伏期减短，错误次数增多（P＜0.001）；与模型组相比，BYHWD 各剂量组避暗潜伏期增长，错误次数减少（P＜0.001）。

表2 BYHWD 对APP/PS1 小鼠避暗实验的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表2 BYHWD 对APP/PS1 小鼠避暗实验的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of BYHWD on dark avoidance experiments in the APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：与对照组相比，***P＜0.001；与模型组相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

组别避暗潜伏期/s错误次数对照组263.43±14.551.15±0.32模型组124.00±20.11***2.80±0.48***多奈哌齐组234.54±20.20###1.61±0.31###BYHWD 高剂量组228.17±17.10###1.68±0.30###BYHWD 中剂量组220.35±17.34###1.78±0.20###BYHWD 低剂量组212.72±17.26###1.79±0.27###

2.2.4 HE 染色 取出海马组织，4%多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇及二甲苯脱水，每步15～20 min，石蜡包埋备用。切片后用苏木素-伊红进行染色、封片，在显微镜下观察小鼠海马的病理学改变，结果见图5。对照组小鼠海马CA1 区细胞体积较大，结构清晰，染色均匀。模型组CA1 区细胞数量少，体积小，胞质不丰富，可见空泡类物质。多奈哌齐组细胞与模型组相比数量较多，排列紧密，结构清晰。BYHWD 高剂量组CA1 区细胞数量多，体积大，结构清晰；BYHWD 中剂量组CA1 区细胞略多，体积略大，结构清晰；BYHWD 低剂量组CA1区细胞排列分散无序，结构不清晰。

图5 BYHWD 对APP/PS1 小鼠海马形态的影响（×400）Fig 5 Effect of BYHWD on the hippocampal morphology in the APP/PS1 mice（×400）

2.2.5 IHC 法 取海马组织切片进行脱蜡、脱水，抗原修复后用3%H2O2孵育10 min，PBS 清洗3 次；滴加血清封闭20 min，弃去血清；加入50 μL PBS稀释过的一抗（1∶300），室温静置1 h，PBS 清洗3 次；滴加50 μL 二抗（1∶500），室温静置30 min，PBS 清洗3 次；DAB 显色5～10 min，流水冲洗终止显色；苏木精复染，脱水、透明、封片。显微镜观察海马区RAGE、LRP1、ApoE 和VCAM-1阳性细胞，利用取上不取下的方法对压边线的细胞计数。结果见表3及图6，与对照组相比，模型组LRP1、ApoE 阳性细胞数表达降低，RAGE、VCAM-1 阳性细胞数表达增加，差异有统计学意义（P＜0.001）；与模型组相比，BYHWD 各剂量组LRP1、ApoE 阳性细胞数表达增加，RAGE、VCAM-1 阳性细胞数表达显著降低（P＜0.001）。

图6 BYHWD 对APP/PS1 小鼠海马RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 蛋白表达的影响（×400）Fig 6 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of the APP/PS1 mice（×400）

表3 BYHWD 对APP/PS1 小鼠海马RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表达的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

表3 BYHWD 对APP/PS1 小鼠海马RAGE、LRP1、ApoE 及VCAM-1 表达的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of BYHWD on the expressions of RAGE，LRP1，ApoE and VCAM-1 in the hippocampus of APP/PS1 mice (±s，n＝10)

注：与对照组相比，***P＜0.001；与模型组相比，###P＜0.001。Note：Compared with the control group，***P＜0.001；compared with the model group，###P＜0.001.

组别RAGELRP1ApoEVCAM-1对照组22.75±1.4586.86±3.3742.55±3.20 48.29±10.59模型组48.79±3.11***12.39±1.05*** 8.72±1.94***363.30±5.28***多奈哌齐组26.03±2.35###67.80±4.04###33.58±1.91###123.50±1.20###BYHWD 高剂量组24.03±1.04###48.74±3.17###25.03±2.57### 64.51±2.48###BYHWD 中剂量组34.07±3.48###25.56±2.13###18.54±1.82###182.90±10.90###BYHWD 低剂量组32.83±2.36###35.36±0.57###15.05±1.39###234.60±25.50###

2.3 数据处理

采用统计学软件SPSS 18.0 分析处理实验数据，均值加减标准差（±s）进行表示，实验数据符合正态分布，方差齐，采用单因素方差分析进行比较，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 讨论

气虚血瘀，脑络瘀阻，脑失濡养是AD 发生发展的重要病机，与之相适应，益气活血通络为其主要治则[7]。BYHWD 中君药黄芪补气行血，臣药当归活血祛瘀，佐以赤芍、川芎、桃仁、红花助当归活血化瘀，地龙通经活络，全方共奏补气、活血、化瘀通络之效。已有研究证实BYHWD 对AD 有很好的作用[3-4]，但作用机制尚不明确。而祛瘀通络药可以通过改善BBB 对脑源性疾病进行治疗[8]。BYHWD 作为祛瘀通络药，很有可能通过改善BBB 治疗AD，本文运用网络药理学和动物实验探究BYHWD 治疗AD 的作用机制。

与前期BYHWD 网络药理学研究相比[9]，本文补充了AD 靶点，通过文献检索等方法丰富了组方药材的活性成分及作用靶点，将BYHWD 抗AD 的潜在靶点由33 个丰富至163 个。KEGG 分析结果发现BYHWD 主要通过AD、胆固醇代谢、脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE 等信号通路治疗AD。潜在核心靶点VCAM-1、ApoE 与这些通路密切相关。AD 通路中VCAM-1、ApoE 的上游，RAGE/LRP1 转运体已被证实可以介导 Aβ跨BBB 转运，RAGE 介导 Aβ的内吞转运，LRP1 介导 Aβ的外排转运[10]，这与前期猜想一致，说明BYHWD 可通过改善BBB 达到治疗AD 的作用。

目前，AD 的主要病理特征是脑内Aβ异常沉积形成的老年斑和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结，中枢Aβ含量是核心发病因素。VCAM-1 是RAGE 的配体[11]，为可诱导的血管细胞黏附分子，研究证实AD 患者RAGE 水平升高，Aβ内吞转运增强，Aβ过渡沉积可刺激VCAM-1 表达，其表达水平还与炎症细胞因子相关[12-13]。ApoE 是LRP1 的配体，可与 Aβ结合成复合物，通过BBB 跨膜转运进入外周血液或被溶酶体吞噬降解[14-15]。高度脂化的ApoE 可以大幅增强与Aβ的亲和性，从而促进胰岛素降解酶对Aβ的降解能力，有效清除脑内Aβ。

本文利用动物实验检测BYHWD 给药后RAGE、LRP1、ApoE、VCAM-1 的表达水平，对网络药理学预测结果进行实验验证，进一步探究BYHWD 是否通过调节RAGE/LRP1 转运体，改善BBB 转运异常，发挥抗AD 的作用。

基于APP/PS1 小鼠的特点，该动物模型适用于药物对AD 预防及治疗的基础性研究[16]。学习和记忆障碍是AD 早期出现的临床表现[17]，且贯穿于整个疾病过程中，本文根据学习记忆障碍的改善情况来评价BYHWD 对APP/PS1 小鼠的治疗效果。与空间学习记忆相关的主要区域位于海马区，海马区对于情绪记忆方面也具有调节作用。研究表明，随着海马区损毁程度加大，空间学习记忆能力会不断下降直至丧失，而且对于情绪记忆的能力也随之下降[18-19]。故本文先通过行为学实验发现给药后APP/PS1 小鼠的新物体识别指数得到改善，避暗潜伏期上升，错误次数下降，表明BYHWD 可改善动物的学习记忆能力。又利用HE 染色观察海马神经元结构，从形态学角度再次验证BYHWD 对APP/PS1 小鼠的治疗效果。IHC 结果表明，经BYHWD 干预后，海马LRP1、ApoE 表达水平上调，RAGE、VCAM-1 表达水平下调，证明BYHWD 可通过调节RAGE/LRP1 转运体，改善APP/PS1 小鼠学习记忆能力。

综上，本文根据BYHWD 传统功效猜测其可能通过改善BBB 治疗AD，网络药理学筛选出BYHWD 抗AD 潜在核心靶点VCAM-1、ApoE，研究证明它们的上游——RAGE/LRP1 转运体已明确可以介导 Aβ跨BBB 转运。经过动物实验发现BYHWD 给药后可以改善APP/PS1 小鼠学习记忆能力，治疗机制与调节RAGE/LRP1 转运体关键蛋白表达有密切关联，即上调LRP1、ApoE，下调RAGE、VCAM-1，验证了网络药理学的预测及前期猜想。本研究为BYHWD 治疗AD 提供了理论基础，但其具体机制还有待进一步研究。