紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复石油污染土壤

张金秋， 王帅杰， 王 露， 付雨潼

(燕山大学 环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004)

在中国能源生产结构中，石油是仅次于煤炭的第二大能源种类[1]。随着石油需求量的不断增加，石油行业迅速发展。然而，石油在开采、储存、运输、加工及使用过程中的溢出和泄漏造成了大面积的土壤污染[2-3]。石油进入土壤后，不仅会改变土壤理化性质，影响作物生长[4-5]，有毒组分还会在植物体内积累并进而危害人类健康[6-7]。石油造成的土壤污染已成为中国急需解决的问题。

目前，修复石油污染土壤的主要方法有物理法、化学法和生物法[8]。其中，原位生物修复因其经济、环保等优点而受到广泛关注，可用于大规模的土壤污染治理[9]。土壤在受到石油污染后，石油组分中的难挥发性有机物质会长期残留在土壤中，对土壤中的营养结构和微生态造成负面影响。在土壤中，具有石油降解能力的微生物相对较少，自然净化非常缓慢，修复周期较长[10-11]。近年来，有研究表明[12-13]，在土壤中添加高效石油降解菌，可以有效解决土著石油降解微生物种群少、降解过程缓慢的问题，而将植物与微生物联合用于修复石油污染环境，既可以提高彼此对不利环境的抵抗力，还能促进石油的自然降解。因此，笔者在石油污染土壤中加入高效石油降解菌，并种植石油耐受性较强的植物——紫花苜蓿，探究植物-微生物联合修复石油污染土壤的可行性，分析其综合效应机理。并对影响植物-微生物联合修复效果的因素开展研究，优化修复条件，为石油污染土壤的生物修复提供科学参考。

1 实验部分

1.1 实验材料

土壤样品采自秦皇岛市某农田，破碎及除杂质后过2 mm筛备用，土壤样品的理化性质如表1所示。

表1 土壤样品的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soil sample

0#柴油购于中国石油化工股份有限公司；紫花苜蓿种子购于秦皇岛市某花卉市场；正己烷、石油醚、无水硫酸钠、磷酸氢二钾、尿素、营养琼脂、醋酸、浓硫酸、硼酸、硫酸亚铁、钼酸铵、重铬酸钾，均为分析纯，购于秦皇岛化学试剂厂；酒石酸锑钾，分析纯，购于阿拉丁生化科技股份有限公司；邻联甲苯胺，分析纯，购于广州臻萃检技术服务有限公司。

高效石油降解菌购于西安瑞捷生物有限公司，将菌剂在普通营养琼脂培养基上进行分离纯化，得菌落形态如图1 (a)所示。由图1 (a)可以看出，培养基中的菌落表面光滑湿润，且产生绿色色素。用扫描电镜(EM-30AXN，欧波同有限公司产品)观察菌株形态，结果如图1 (b)所示。由图1 (b)可以看到菌体呈杆状，经过16SrDNA生物分子学鉴定，该菌种属于假单胞菌属(Pseudomonassp.)，与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosastrain)的同源性不低于99.86%。

图1 高效石油降解菌的形态Fig.1 Morphology of efficient petroleum degrading bacteria(a) The colony morphology； (b) The morphology of strains

1.2 石油污染土壤的配制

将0#柴油与石油醚按照体积比1∶1于90 ℃的恒温水浴锅中蒸馏，得到标准油。每个花盆中均加入1.5 kg的去除杂质的土壤，称取一定量的标准油加入到花盆中，与土壤混拌均匀，放置在通风处通风2 d备用。

1.3 石油污染土壤修复实验

盆内土壤中石油质量分数均设为0.6%，设计4组实验：对照组(CK)，紫花苜蓿修复组(OP)，铜绿假单胞菌修复组(OM)，紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复组(PM)。每组设置3个平行样。CK组不作任何处理，向OM、PM组花盆中加入30 g高效降解菌菌粉(污染土壤中菌剂质量分数为20 g/kg)，与土壤混拌均匀。筛选颗粒饱满、无虫蛀的紫花苜蓿种子，分别向OP、PM组的花盆中播种60粒种子(种植密度为20棵/dm2)，埋至土下2 cm左右。所有实验场地温度均为20～25 ℃，定时定量浇水，保持土壤含水量(质量分数)为50%，定期翻耕。定期测定植物的生长状况、土壤中的微生物数量及土壤中石油含量。

1.4 紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复影响因素考察实验

为优化紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复条件，考察了土壤中石油污染程度、植株种植密度、菌剂用量、营养物(N、P)对石油污染土壤修复效果的影响。考察土壤中石油污染程度对修复效果的影响时，土壤中石油初始质量分数分别设置为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，污染土壤中菌剂质量分数为20 g/kg，植株种植密度为20棵/dm2；考察植株种植密度对修复效果的影响时，植株种植密度设置为：10、20、30棵/dm2，土壤中石油质量分数为0.6%，菌剂质量分数为20 g/kg；考察菌剂用量对修复效果的影响时，土壤中菌剂质量分数设置为7、20、40 g/kg，土壤中石油质量分数为0.6%，植株种植密度为20棵/dm2；考察营养物(N、P)对修复效果的影响时，土壤中营养物P的添加量为3.3 g K2HPO4/kg，土壤中N的添加量分别为8、13.3、40 g尿素/kg，使N、P元素的摩尔比分别为6∶1、10∶1、30∶1，土壤中石油质量分数为0.6%，植株种植密度为20棵/dm2，菌剂质量分数为20 g/kg。

1.5 分析及计算方法

土壤有机质、全氮、全磷、水分、pH值等理化性质的测定参照GB 9834—1988、GB 7173—1987、GB 9837—1988、GB 7172—1987、NY/T 1377—2007标准方法；使用紫外分光光度计(WFZ-24A，上海棱光技术有限公司产品)和超声波清洗器(KQ-100，昆山市超声仪器有限公司产品)通过超声萃取-紫外分光光度法测定土壤中石油含量；采用平板菌落计数法测定土壤中的微生物数量；使用可见光分光光度计(722SP，上海棱光技术有限公司产品)通过邻联甲苯胺比色法测定漆酶的活性。

土壤中石油污染物的去除率采用式(1)进行计算，动力学拟合方法见式(2)～式(4)。

η=[(w0-w)/w]×100%

(1)

零级动力学方程：

w0-w=k0t

(2)

一级动力学方程：

ln(w/w0)=-k1t

(3)

二级动力学方程：

(1/w)-(1/w0)=k2t

(4)

式中：η为石油的去除率，%；w0、w分别为土壤中石油初始质量分数、土壤中石油残留质量分数，mg/kg；k0(mg/(kg·d))、k1(d-1)、k2(kg/(mg·d))分别为零级、一级、二级反应速率常数。

2 结果与讨论

2.1 不同修复系统中石油的降解

不同修复系统中，土壤中石油的降解曲线如图2(a)所示。由图2(a)可以看出，CK组中，虽然未做任何修复处理，56 d后土壤中石油质量分数仍然减少了12.5%，这可能是由于石油的挥发和土壤中土著微生物的降解作用。相对于CK组，OM组的石油去除率提高近1倍，达23.6%，高效石油降解菌对石油污染物的降解能力远高于土著微生物。OP组的石油去除率为46.5%，约是OM组的1倍，比CK组提高了近3倍。经观察，OP组和PM组紫花苜蓿的茎长，叶片是三叶草形状，面积大，蒸腾能力较强，吸收营养物质的能力也较强。此外，有研究表明，紫花苜蓿根部会产生漆酶[14]，可以通过自由基催化反应来氧化各种芳香族和非芳香族化合物，对石油有较好的降解作用。经笔者研究测定，紫花苜蓿根系中的漆酶活性高达40 U/g，根际土中漆酶活性为22 U/g，非根际土壤也检测到了低漆酶活性，因此紫花苜蓿降解石油污染物的能力较强。4组实验中，PM组的修复效果最好，第56 d时，其土壤中石油去除率高达71.9%，远高于OP组和OM组，甚至高于两者之和。

根据图2(a)中数据分别进行了零级、一级、二级动力学拟合，结果表明，不同修复系统中石油的降解更符合准一级动力学，见图2(b)，即土壤中石油的降解速率与石油初始含量的一次方成正比关系，反应速率常数从大到小顺序依次为：PM组(0.0250 d-1)、OP组(0.0130 d-1)、OM组(0.0054 d-1)。

η—Oil removal rate； w0—Initial content of petroleum in soil; w—Residual content of petroleum in soil；CK—Control group; OP—Alfalfa remediation group; OM—Pseudomonas aeruginosa remediation group;PM—Alfalfa-Pseudomonas aeruginosa combined remediation group图2 不同修复系统中石油的降解曲线及动力学拟合Fig.2 Degradation curves and degradation kinetic fittings of petroleum in different remediation systems(a) Degradation curves; (b) Degradation kinetics

2.2 植物-微生物修复综合效应机理探究

如前所述，相对于单一微生物和植物紫花苜蓿和铜绿假单胞菌修复，紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复系统中石油的去除率及降解速率均有明显提高，甚至高于两者的线性之和。为了探究产生综合效应的原因，测定了不同修复处理过程中，土壤中微生物的数量变化情况和紫花苜蓿的生长状况，结果如图3和图4所示。

图3 OM组和PM组微生物数量(N)的对比Fig.3 Comparison of microbial number (N)between OM group and PM group

由图3可以看出，OM组和PM组微生物的生长均出现了一定的停滞期，但PM组略短，在8 d后微生物的数量开始呈现增长趋势。整个修复过程中，PM组土壤中的微生物数量均多于OM组，特别是中后期，差异加大，这与植物的生长状况密切相关，紫花苜蓿强大的根系为土壤中的微生物提供了更大的生存面积，其根系分泌物和更多的降解产物为微生物的生长繁殖提供更多的养分，促进土壤中微生物的繁殖和生长。图4结果表明，PM组不同时期紫花苜蓿的株高和叶宽均大于OP组，即植物的生长情况明显优于OP组，这可能是由于微生物的代谢作用使土壤中的石油降解加快，降解产物为植物提供了更多的营养物质，促进植物旺盛生长。在联合修复体系中，植物和微生物表现出明显的互生关系，彼此促进生长，因此，表现出更好的修复效果。

图4 OP组和PM组紫花苜蓿生长状况对比Fig.4 Comparison of Alfalfa growth status betweenOP group and PM group

2.3 紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复(PM组)的影响因素

2.3.1 石油污染程度对石油污染土壤修复效果的影响

在不同石油初始含量下土壤中石油的降解曲线如图5所示。从图5可以看出，石油初始质量分数为0.3%和0.6%的石油污染土壤修复的效果较好，56 d后石油的去除率高达72%。当石油初始质量分数增至0.9%时，56 d后石油的去除率约为62%。而石油初始质量分数为1.2%和1.5%时，56 d后土壤中石油的去除率不足50%。这可能是因为较低含量的石油可以作为紫花苜蓿和石油降解菌生长和繁殖的营养物质；而过量的石油会产生一定的毒性，抑制植物及微生物的生长发育，且石油含量过高，还会造成土壤孔隙度下降，土壤中的氧含量减少，植物根系和微生物的呼吸作用减弱，最终导致修复效果下降。

η—Oil removal rate图5 石油初始含量对石油污染土壤修复的影响Fig.5 Effect of initial petroleum content onremediation of petroleum contaminated soilThe planting density of Alfalfa was 20 seeds/dm2 and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

2.3.2 植株种植密度对石油污染土壤修复效果的影响

紫花苜蓿种植密度对石油污染土壤修复效果的影响如图6所示。由图6可见：当植株密度由10棵/dm2增至20棵/dm2，第56 d时石油的去除率由51.3%提高到72%；但当植株密度提高至30棵/dm2时，土壤中石油的去除率反而略有下降。这是因为当植株种植过于密集时，群体之间相互遮挡，通风透光变差，根系生长空间相对狭小，相互交缠，营养物质消耗快，使得植物生长周期变短，微生物呼吸变弱，活性下降，导致石油降解效果变差。因此，紫花苜蓿种植密度为20棵/dm2较为合适。

η—Oil removal rate图6 紫花苜蓿种植密度对石油污染土壤修复的影响Fig.6 Effect of planting density of Alfalfa on remediationof petroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6% and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

2.3.3 菌剂添加量对石油污染土壤修复效果的影响

菌剂添加量对石油污染土壤修复效果的影响如图7所示。从图7可以看出:当土壤中铜绿假单胞菌菌剂添加量由7 g/kg增加至20 g/kg时，石油的去除率明显提高；但当由20 g/kg增加至40 g/kg时，修复效果相差无几。由此可见，菌剂添加量并不是越多越好，添加量过多，营养物质消耗过快，微生物生长相对缓慢、活性降低，不能发挥最大的修复作用。因此，土壤中菌剂添加量为20 g/kg较为经济。

η—Oil removal rate图7 菌剂添加量对石油污染土壤修复的影响Fig.7 Effect of dosage of bacterial agent on theremediation of petroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6% andthe planting density of Alfalfa was 20 seeds/dm2.

2.3.4 营养物对石油污染土壤修复效果的影响

营养物对石油污染土壤修复效果的影响如图8所示。由图8可见，适量的营养物对石油污染土壤的修复有明显促进作用。相比于未加营养物组，当N/P摩尔比为6∶1和10∶1时，土壤中石油的去除率均有明显增加，特别是当N/P摩尔比为10∶1时，56 d后石油的去除率高达85.5%，比不加营养物组(图5)增加了13.5百分点。但当N/P摩尔比为30∶1时，土壤中石油的去除率有所下降，部分植物出现了烧苗现象。这说明，适量的营养物有助于植物和微生物的生长发育，但添加过量，可能使植物无法正常生长，也可能造成微生物细胞脱水，降低活性，影响修复效果。

η—Oil removal rate图8 营养物对石油污染土壤修复的影响Fig.8 Effect of nutrients on the remediation ofpetroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6%, the plantingdensity of Alfalfa was 20 seeds/dm2 and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

3 结 论

(1)紫花苜蓿-铜绿假单胞菌联合修复可更高效地去除土壤中的石油，石油的去除率及降解速率均远胜单一修复方式，56 d内石油去除率高达72%，反应速率常数达0.0250 d-1。在联合修复体系中，铜绿假单胞菌与紫花苜蓿表现出了明显的互生现象。

(2)当土壤中石油的初始质量分数为0.6%，紫花苜蓿植株密度为20棵/dm2，土壤中铜绿假单胞菌菌剂投加质量分数为20 g/kg时，植物-微生物联合修复效果最好，且修复体系得以充分利用。

(3)在石油污染土壤修复过程中，添加适量的氮、磷营养物有显著的促进作用。当氮、磷元素摩尔比为10∶1时效果最好，土壤中石油的去除率比不加营养物组提高了13.5百分点。