桔梗皂苷D治疗肥胖的潜在作用机制研究*

王贤， 钟沁， 刘芳， 韦睿然， 桂黎明*

(1.贵州医科大学 基础医学院 免疫学教研室, 贵州 贵阳 550000； 2.安徽医科大学 临床医学院 基础医学部, 安徽 合肥 230031)

肥胖是一类慢性代谢性疾病，与许多疾病密切相关，包括脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、2 型糖尿病、肝胆疾病、动脉粥样硬化和缺血性心脏病等[1-6]。世界肥胖问题工作小组采用身体质量指数(body mass index,BMI)作为超重与肥胖的判定标准[7]，BMI ≥28 kg/m2时，即可判定为肥胖，肥胖的患病率正呈现逐年上升趋势，已经成为世界健康问题之一。据估计，未来 20 年肥胖仍会持续增长[8]，因此解决并改善肥胖问题刻不容缓。目前，主要通过饮食运动疗法、抗肥胖药物、外科手段减轻肥胖，但效果均不理想[9-12]。桔梗皂苷 D (platycodin D，PD)是从传统中药桔梗里提取的一种三萜类单体的皂苷成分，在桔梗里含量相对较高且为其主要生物活性成分，具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、增强免疫等多种药理作用[13-14]。相关研究表明，PD 能抑制胰脂肪酶活性，从而抑制肠道对食物脂肪的吸收[15]；动物实验表明，PD 通过调节脂肪生成和产热来减轻 db/db 小鼠的肥胖[16]。小鼠成纤维 3T3-L1细胞是一种特征明确的前脂肪细胞，具有从前体细胞分化为成熟脂肪细胞的潜力[17]，是体外研究脂肪酸代谢和肥胖的成熟细胞模型[18-21]。本研究运用网络药理学与分子对接技术预测PD 干预肥胖的分子靶点与潜在作用机制，并通过体外实验初步验证PD 抑制 3T3-L1 前脂肪细胞分化的作用机制，观察促进白色脂肪细胞生成的关键基因-固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)的mRNA和蛋白的表达水平[22-24]，为肥胖治疗的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞来源 小鼠成纤维 3T3-L1 前脂肪细胞株来自于中国科学院干细胞库(SCSP- 5038)。

1.1.2药物 PD粉末纯度98.34%(MCE, HY-N1411)，使用 DMSO配制成 10 mmol/L 的母液备用。

1.1.3主要试剂与仪器 DMEM 高糖培养基(GIBCO, 美国)，新生小牛血清(Ausbian，澳大利亚)，胎牛血清(Vistech, 丹麦)，青/链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺(GIBCO, 美国)，Dexamethasone、IBMX、Rosiglitazone(Sigma-Aldrich，美国)，Insulin(Solarbio，中国)，CCK-8 细胞增殖检测试剂盒(Biosharp，中国)，油红 O 染色试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(Solarbio，中国)，RNA 快速提取试剂盒、快速逆转录试剂盒、2×Super SYBR qPCR Master MIX(ES science，中国)，一抗蛋白(SREBP-1c、FAS)、二抗蛋白(Affinity，中国)。多功能酶标仪(Bio-tek，美国)，倒置荧光显微镜(Leica，德国)，实时荧光定量 PCR 仪(Bio-Rad，美国)，蛋白化学发光成像系统(Bio-Rad，美国)。

1.2 网络药理学与分子对接分析

1.2.1药物靶点预测 通过 Pubchem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取PD 的 Smiles 结构式，文件以 SDF 格式保存并导入 Swiss Target Prediction 数据库(http://www.swisstarget-prediction.ch/index.php)进行活性成分的靶点预测，以“小鼠”为研究物种收集靶点，去除重复项，整理这些靶点的蛋白名称、基因名称及 UniPort ID 等信息。

1.2.2肥胖的靶点预测 在 Gene Cards 数据库(http://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、TTD 数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)中输入关键词 “obesity” 作为检索条件，并将筛选条件设置为score≥20，收集并整理 3 个数据库共同收录的肥胖相关疾病靶点。

1.2.3PD与肥胖的共同靶点筛选 将获取的药物与疾病相关靶点输入微生信在线平台，获得两者靶点蛋白交集的维恩图。

1.2.4蛋白相互作用(PPI)网络构建 采用 STING 数据库(https://stringdb.org/cgi/input.pl)对获取的药物—疾病靶点进行分析[25]，本研究设定最小互作分数值≥0.7，筛选潜在作用核心靶点，并应用 Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化处理。

1.2.5GO功能与KEGG富集分析 通过 R软件(https://www.rproject.org)对药物与疾病相关靶点进行 基因本体分析(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析[26]。基因名称选择为“OFFICE_GENE_SYMBOL”，选择 GO 功能中的生物过程(biological processes，BP)、分子功能(molecular functions，MF)和细胞组分(cellular components，CC)3 个参数对基因进行富集；使用 R 语言进行 KEGG 通路富集分析，根据调整后的P值(P<0.05)进行排序。通过微生信进行数据可视化处理，得到条形图及气泡图。

1.2.6药物-靶点-通路可视化网络构建 将药物与疾病共同基因数据导入 Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org)软件构建药物-靶点-疾病网络图，以网络 degree、betweenness centrality和 Closeness 为筛选条件，挖掘网络核心节点。

1.2.7分子对接 在 Pubchem 数据库下载PD活性成分的 2D 结构图，通过 PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载核心靶点的配体结构，使用 Autodock Vina 对接每个成分和配体，获取结合能最高的位点，最后使用 PyMol 软件(https://pymol.org/)对对接结果进行可视化分析。根据相关文献可知，结合能≤-5.0 kcal/mol的对接分数表明该化合物与靶点之间具有良好的结合活性，且结合能越小代表二者间结合的活性越好。

1.3 细胞实验

1.3.1细胞培养 3T3-L1前脂肪细胞在 37 ℃、5% CO2的培养箱中用完全培养基(高糖DMEM培养基+10%新生小牛血清+1%青链霉素+1%丙酮酸钠+1%非必需氨基酸+1% L-谷氨酰胺)进行常规传代培养。

1.3.2细胞增殖实验(CCK-8)法测定细胞存活率 收集对数生长期的 3T3-L1细胞，按 1×104个细胞/孔接种于 96 孔板，待细胞生长状态良好时，第2天加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD，每个浓度设置 6 个复孔，另设对照组(不加 PD)与空白组(仅含培养基，不含 PD，不接种细胞)，分别处理24、48及72 h，取CCK-8溶液10 μL加到96孔板，温育2 h ，采用多功能酶标仪检测450 nm 波长处细胞吸光度值(optical density, OD)。

1.3.3细胞凋亡率 采用流式细胞术检测，将细胞以1×106个细胞/孔接种于6 孔板后放置培养箱中培养，待细胞生长状态良好时，加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD分别处理 24、48及72 h；取胰酶100 μL消化贴壁细胞，加入 1 mL 培养基终止消化并吹打均匀，细胞悬液收集至EP 管中，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清；加入 PBS 重悬 1 次，去离子水按照1 ∶3稀释结合缓冲液，用1×Binding buffer 重新悬浮细胞，调节浓度为1×109个细胞/L；取细胞悬液100 μL 加入5 mL 的流式管，加入 Annexin V- Alexa flour647 染液5 μL，混匀后室温避光培养5 min，再加入20 mg/L PI 染液10 μL，加入 PBS 400 μL，立刻进行流式检测，收集数据并分析。

1.3.43T3-L1前脂肪细胞的诱导分化 取对数生长期的 3T3-L1细胞以1×106个细胞/孔接种于6孔板，待细胞生长融合至80%时，根据 Zebisch 等[24]的实验方法对细胞进行诱导分化，先将1 mg/L Insulin、0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L Dexamethasone 及2 μmol/L Rosiglitazone 同时加入高糖 DMEM培养液(含10%胎牛血清和1%青/链霉素)中诱导3T3-L1细胞 48 h，再用仅含1 mg/L Insulin 的培养液继续诱导48 h，最后换用不添加任何诱导成分的培养基继续培养细胞，直至镜下出现脂滴。在分别给予5、10及20 μmol/L PD处理细胞，并设对照组(不加PD)。收集诱导完成后的细胞，采用油红O染色检测 PD细胞中脂滴的积累情况，采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测不同浓度 PD 对SREBP-1c、FAS的 mRNA 及蛋白表达的影响。

1.3.5油红O染色 去除培养基、PBS 洗涤、固定液固定细胞 25 min、去除固定液，使用双蒸水洗涤 2 次，加入 60% 异丙醇浸洗 5 min，弃去异丙醇后直接加入新鲜配制好的油红 O 染色工作液，浸染 30 min；染色完毕后，双蒸水洗涤 5 次，每孔加入双蒸水覆盖细胞，倒置显微镜下观察染色情况并拍照。

1.3.6RT-qRCR 检测SREBP-1c、FASmRNA表达 使用RNA快速提取试剂盒提取总RNA，同时测定RNA纯度与浓度，随后将总RNA反转录为cDNA，反转录条件为设定为42 ℃ 15 min; 最后使用2× Super SYBR green qPCR Master Mix进行实时荧光定量PCR检测，条件设定为95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 共40个循环。采用2-ΔΔCt法分析mRNA相对表达量。SREBP-1c 上游引物序列为5′- GACGAC-GGAGCCATGGATT -3′，下游引物序列为 5′-CAGCAGTGAGTCTGCCTT-GAT -3′, 目的片段672 bp；FAS 上游引物序列为5′- GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3′，下游引物序列为 5′- TGGG-TAATCCATAGAGCCCAG -3′，目的片段140 bp；内参照β-actin 上游引物序列为5′- CATGTACGTTGCT-ATCCAGGC -3′，下游引物序列为5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT -3′, 目的片段250 bp。

1.3.7Western blot 检测 SREBP-1c、FAS 蛋白表达 使用RIPA裂解液(含1% PMSF)裂解细胞提取总蛋白，BCA 蛋白浓度检测定量各组总蛋白浓度;采用10%的 SDS-PAGE 凝胶分离蛋白，随后转印至 PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h，TBST洗涤后，SREBP-1c、FAS蛋白一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 孵育过夜，TBST 洗涤后，二抗(1 ∶3 000)室温孵育 1.5 h，TBST 洗涤后，ECL 显影后应用 Image Lab 软件分析条带的灰度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 网络药理学与分子对接分析

2.1.1PD潜在作用靶点筛选 通过 STD、HERB、SuperPred PharmMapper、SwissTargrtPrediction、SEA 数据库进行靶点预测，共找到 539 个靶点，使用 UniProt 数据库规范命名并排除重复靶点，共获得 438 个靶点。

2.1.2肥胖潜在靶点获取 在 TTD、 GeneCards、OMIM 数据库搜索与肥胖相关的靶点，合并去除重复后共得到 1 104 个疾病靶点。

2.1.3PD与肥胖交集靶点 将获得的PD靶点与肥胖疾病靶点上传微生信在线平台，靶点合并取交集得到维恩图，获得 131 个交集靶点(图1)。

图1 药物与肥胖共同靶点韦恩图

2.1.4PPI网络的构建及核心蛋白的筛选 将药物与疾病的131个共同靶点导入STRING 数据库得到 txt 文本文件，随后将文本导入 Cytoscape 3.7.2 软件进行分析和可视化处理(图2)，网络拓扑分析显示，PPI网络共含有124个节点，1 794条边。采用 Cytohubba 插件中的MCC算法，根据度值共获得10个核心靶点基因，包括包括蛋白激酶B α(protein kinase B α,AKT1)、信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)、肿瘤蛋白53(tumor protein p53,TP53)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)白介素6(Interleukin-6,IL6)等(表1)。

图2 PD治疗肥胖的“药物-靶点-通路”网络图

表1 PD治疗肥胖的潜在核心靶点

2.1.5PD对肥胖作用靶点的生物学分析 使用R软件对PD对肥胖作用靶点基因进行GO功能富集分析，共获得2 614个GO条目(P<0.05)，分别选取BP、CC MF的Count值排名前十的条目(图3)。BP条目有2 444个，其中包括营养水平反应(response to nutrient levels)、细胞对氧化应激的反应(cellular response to oxidative stress)、肌肉细胞增殖(muscle cell proliferation)、类固醇激素反应(response to steroid hormone)及脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)等； CC条目有 27 个，其中包括细胞质膜(membrane raft)、常染色质(euchromatin)、RNA 聚合酶Ⅱ转录调节复合物(RNA polymerase Ⅱ transcription regulator complex)、转录调节复合物(transcription regulator complex)及微膜区(membrane microdomain)等； MF条目有 143 个，包括核受体活性(nuclear receptor activity)、类固醇结合(steroid binding)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA binding transcription factor binding)及转录共调节子结合(transcription coregulator binding)等。根据P<0.05 进行 KEGG 通路富集，共获得 154 条相关通路，选取P值排名靠前的 20 条通路利用微生信制作气泡图(图4)，得到PD 治疗肥胖的主要信号通路包括酒精性肝病(alcoholic liver disease)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、AMPK 信号通路(AMPK signaling pathway)(图5)、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、HIF-1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)、脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway)及AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway)等。

图3 PD治疗肥胖核心靶点的 GO 功能富集分析

图4 KEGG 功能富集分析

图5 PD治疗肥胖症作用的 AMPK 信号通路

2.1.6PD-肥胖靶点-通路网络构建 将PD和肥胖症共同靶点导入 Cytoscape 3.7.2 软件，获得P D-靶点-肥胖网络(图6)，该网络共有 152 个节点、560 条边。

注：图中深灰色代表PD，其他代表PD 的相关靶点及信号通路，边代表两者之间的关系。

2.1.7分子对接结果分析 为了从分子水平阐明PD 与关键白蛋靶点 AMPK、SREBP1c、FAS 的作用模式，通过Autodock软件进行分子对接，结合能见表 2，由此可知蛋白与化合物对接相互作用的结合能在 -10.2～-8.8 kcal/mol，提示本实验的数据与结果较为可靠，具有较高的参考价值。图7为PD与肥胖核心靶点的分子对接模式图。

表2 PD 与关键蛋白靶点结合能

注：A、B、C依次为 AMPK、SREBP-1c、FAS 对接结果。

2.2 细胞实验

2.2.13T3-L1前脂肪细胞存活率 CCK-8结果显示(图 8)，使用不同浓度 PD 处理3T3-L1前脂肪细胞 24、48及72 h，PD<20 μmol/L对细胞无明显毒副作用(细胞存活率均在90% 以上)；PD>20 μmol/L细胞毒作用明显增强，细胞存活率明显降低 (P<0.001)，表明 PD 抑制细胞增殖作用呈浓度依赖性。因此，选择 20 μmol/L PD作为最大给药浓度，后续实验在该浓度范围内进行。

注：(1)与对照组相比，P<0.001。

2.2.2PD对3T3-L1细胞凋亡的影响 收集培养24、48及72 h 的细胞进行凋亡检测，结果显示：与对照组相比， 5、10及20 μmol/L PD 分别连续培养72 h，3T3-L1前脂肪细胞始终能够保持较高的细胞活性，未发生明显的细胞凋亡(图9)。

注：A 为凋亡率流式图，B 为凋亡率线形图；(1)与同时点对照组相比，P<0.01。

2.2.3PD对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响 结果显示：对照组3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化后出现大量脂滴；在5、10及20 μmol/L PD处理细胞后，细胞内也出现数量不等的脂滴，并且随着PD浓度的增加，脂滴数量逐渐减少，其中，20 μmol/L组中的脂滴含量最少，与对照组的脂滴含量相比，差异有统计学意义(P<0.001)。提示PD 呈浓度效应抑制3T3-L1前脂肪细胞分化(图10)。

图10 不同浓度 PD 对 3T3-L1 前脂肪细胞分化影响

2.2.4不同浓度PD对SREBP-1c和FASmRNA表达的影响SREBP-1c和FAS是促进白色脂肪细胞生成的关键基因，因此，实验进一步探讨PD抑制3T3-L1细胞分化过程中这两种基因的表达情况。RT-qPCR 结果显示(图 11)，与对照组比较，PD各浓度组的SREBP-1c、FASmRNA表达量均出现不同程度的下调(P<0.01)，且SREBP-1c、FASmRNA表达量随着PD浓度的增加而逐渐减低，其中PD为20 μmol/L时降低最为显著。提示 PD 在脂肪细胞分化过程中，能够通过调控细胞中SREBP-1c、FASmRNA表达量来抑制3T3-L1细胞分化成为成熟脂肪细胞。

注：(1)与对照组相比，P<0.01。

2.2.5不同浓度PD对SREBP-1c与FAS蛋白表达的影响 Western blot结果显示(图 12)，与对照组比较，SREBP-1c、FAS蛋白表达量随着PD浓度的升高呈现不同程度的下调，并且与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。提示PD在脂肪细胞分化过程中，能够通过下调细胞中SREBP-1c、FAS蛋白表达进而抑制3T3-L1细胞分化。

注：(1)与对照组相比，P<0.01。

3 讨论

肥胖的发生和发展是一个复杂且涉及多通路的过程，各因子与因子之间、因子与通路之间形成一个相互影响、联系紧密的网络结构。目前，抗肥胖治疗并不乐观，但随着中草药研究的进展，这一情况正逐渐得到改善。中药疗法注重整体观和辨证论治原则，根据不同时期症型选择选择不同治疗方法，标本兼治，且中药药性温和，相对安全。中药因其本身含有多种活性成分，毒效应小，具有多效应、多靶点及多通路途径协同调节的优势。桔梗是我国传统重要的药用资源之一，桔梗属于桔梗科植物Grandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根[27]，含有多种活性成分与较高的生物活性，其本身具有利咽、祛痰、抗炎、降糖及提高免疫力等功能，广泛用于癌症、哮喘、炎症及糖尿病肾病等方面的治疗与研究[28-29]。相关研究表明，桔梗的活性组成部分桔梗总皂甙具有抑制胰脂肪酶活性作用[30]。

在本研究中，利用网络药理学探讨桔梗的主要活性成分PD 对肥胖的分子靶点及潜在作用机制，通过分子对接进行验证。维恩图交集结果显示PD 对肥胖可能起到作用的靶点共131个，推测PD 是通过多个靶点发挥治疗肥胖作用的。PPI 网络结果分析可知，AKT1、EGFR、VEGFA、TP53、STAT3 靶点的自由度值较高，推测这些核心靶点可能在抗肥胖治疗中起到关键作用。AKT1 是胰岛素样生长因子 1 受体在脂肪细胞克隆扩增后分化过程中重要的信号分子，在调节糖脂代谢方面具有重要作用[31]。TNF 和 IL6 是重要的免疫炎症调节因子，促炎因子的表达与肥胖造成的一系列免疫不良反应密切相关，TNF-α 会阻碍胰岛素信号转导，而 IL6 具有加重胰岛素抵抗的作用[32]。GO 与 KEGG 生物学分析结果表明，PD 可通过多个靶点、多条通路影响肥胖的发生与发展。糖脂代谢相关通路与肥胖密切相关，其中，AMPK 信号通路是调控脂质代谢关键的通路之一，AMP依赖的蛋白激酶磷酸化后通过下调其下游脂肪生成相关基因，如 SREBP-1c、FAS 等，从而降低肥胖的发生[33]。此外PD与胰岛素抵抗信号通路、脂肪因子信号通路、AGE-RAGE 信号通路等与糖脂代谢相关的通路均具有联系。分子对接结果显示，PD 与 AMPK 的结合活性最好(-10.2 kcal/mol)，随后是与 FAS(-9.0 kcal/mol)、SREBP-1c(-8.8 kcal/mol)，由对接模型初步验证PD 可能通过 AMPK 信号通路发挥抗肥胖作用机制。

与肥胖关系最密切的是体内脂肪组织。脂肪组织是机体的能量储存器官，也是机体重要的内分泌器官，能够分泌多种细胞因子。正常情况下，脂肪组织具有产热、体温维持、内分泌及支持等功能，有利于身体的能量平衡。目前，哺乳动物体内的脂肪组织按形态特征可分为白色脂肪组织、棕色脂肪组织和米色脂肪组织。白色脂肪组织内的白色脂肪细胞是其主要的细胞类型，是机体主要的脂肪库。棕色脂肪组织内含丰富的线粒体，为机体重要的适应性产热器官。米色脂肪组织是二者之间转化过度的中间体，功能类似于棕色脂肪组织。SREBP-1 是白色脂肪组织产脂基因表达的主要转录因子，SREBP-1c 是主要亚型，在肝脏和白色脂肪细胞中表达，通过激活甘油三酯合成基因进而促进脂肪的生成[34]。FAS 是介导白色脂肪细胞内甘油三酯合成过程中的关键蛋白，催化脂肪从头合成。相关实验研究表明，脂肪组织中 FAS 的表达量与甘油三酯和脂肪合成呈正相关，且 FAS 出现在细胞分化为成熟脂肪过程的中、后期，其下调能减少脂滴的生成[35]。本实验研究发现，PD 在20 μmmol/L 安全范围内能够下调细胞中SREBP-1c、FAS 的表达，抑制脂肪细胞脂滴生成，并且具有浓度效应。

综上所述，本研究从网络药理学与分子对接角度上阐述了PD 对肥胖的分子靶点及潜在作用机制，体外实验结果表明，PD 可抑制前脂肪细胞3T3-L1分化为成熟脂肪细胞，其机制与下调脂肪生成关键因子 SREBP-1c、FAS 的表达有关，但 PD 抑制脂肪生成相关蛋白信号通路仍需后续实验进一步证实。