基因修饰猪-非人灵长类动物异种肾移植面临的问题及挑战

蒋鸿涛 李涛 何松哲 余一凡 白云昊 马晓杰 王毅

为了解决供者短缺的问题，人们采取了很多措施，例如亲属活体移植，ABO血型不相容移植等，我国也在2006年开展了第1例ABO血型不相容肾移植。即便这样，仍不能有效地解决器官短缺问题。正是在这种背景下，人们开始研究将转基因猪作为供体来源之一[1-2]。在基因修饰猪-非人灵长类动物（non-human primate，NHP）的异种器官移植模型中，肾和心脏异种移植取得了令人兴奋的进展。其中移植肾存活时间＞1年[3-4]，移植心脏（原位移植）存活时间＞6个月[5-6]，而异种肝移植和肺移植的进展比较缓慢。虽然目前异种移植研究有所突破，但长期存活的例数仍较少。接受α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除（α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout，GTKO）供体供肾的受体1、3和12个月的存活率分别为47.1%、24.2%和7.6%[7]。可见大部分受体短期内就发生移植肾失功。因此，仍有一些问题需要明确并解决。本文就目前异种肾移植所存在的问题和面临的挑战进行归纳。

1 排斥反应

1.1 固有免疫

由于供体猪和NHP受体之间的分子差异，固有免疫在异种移植排斥反应中的影响明显强于同种移植。巨噬细胞通过识别异种移植物的激活信号和干预抑制信号来介导强烈的排斥反应，笔者所在团队前期研究中也发现猪肾有大量的巨噬细胞浸润。CD47是一种膜糖蛋白，在所有组织中都有表达，并作为“自我标记物”与巨噬细胞中的抑制剂受体信号调节蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）相互作用。SIRPα与CD47之间相互作用的缺失可导致异种移植的排斥反应。此外，被激活的巨噬细胞还可以进一步调节T细胞反应，诱导适应性反应损伤异种移植物。

与巨噬细胞相似，自然杀伤（natural killer，NK）细胞在异种移植中起着关键作用，其作用机制依赖于激活和抑制信号之间的平衡。NK细胞无法有效识别异种组织上的抑制信号，从而损伤异种移植物。然而，一些研究表明NK细胞在异种移植排斥反应中可能未起到关键作用[8]。另外，NK细胞可能被异种细胞的激活配体（比如NKG2D或NKp44及其各自的配体）所激活，加重对移植物的损伤[9]。为了减少NK细胞的活化，研究者们尝试了不同基因修饰方案，如转入人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-E，HLA-Cw3或HLA-Cw4。然而相比于野生型猪，人NK细胞介导的毒性对导入NK细胞抑制分子的猪更高。NK细胞对异种器官损伤的其他机制是抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。因此，这种先天免疫反应在异种器官移植中似乎难以被抑制。有体内实验证实导入CD47能有效延长异种移植肾存活时间[10]，这可能是抑制巨噬细胞吞噬异种组织的重要手段之一，但对于如何有效抑制NK细胞的杀伤作用仍需进一步研究。

1.2 适应性免疫反应

异种移植的适应性排斥反应呈多样性，包括超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）、抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）、T细胞介导的排斥反应（T cell-mediated rejection，TCMR）、亚急性或慢性体液或细胞排斥反应[11]。使用hCD55或GTKO猪作为供肾来源，基本不会发生HAR；以共刺激阻滞剂为基础的维持免疫方案对抑制或逆转TCMR有一定的作用；AMR仍是阻碍临床异种肾移植长期存活的主要障碍，同时伴有或不伴有移植肾微循环血栓形成。为了抑制AMR，人们加大了对猪的基因改造，目前最新的转基因猪是“12基因”猪[12]。然而并非对猪的基因改造越多就越有易于异种肾移植，且过多的基因改造容易造成猪畸形，难以存活。目前存活时间最长的异种肾移植受体，其供猪基因型为GTKO/4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2敲除（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2 knockout，β4GalNT2KO）。笔者所在团队前期研究中即使使用了GTKO/β4GalNT2KO/hCD55/h血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）供猪，受体猕猴存活时间＜30 d，且大部分发生了AMR，表明确实存在其它的未知异种抗原。从2003年以来的基因修饰猪-NHP异种肾移植中，大部分受体都发生了AMR，其中有小部分发生了TCMR。因此，克服AMR才能快速地推动异种肾移植的临床应用。

目前正在进行异种移植研究的药物包括达雷木 单 抗（daratumumab，anti-CD38） 和 贝 利 木 单抗[belimumab，B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）阻滞剂][13]。另一种新药imlifidase可能有一定的作用，它能在4 h内清除循环中的IgG[14]。然而，主要问题是所有抗体水平会在移植后的第1周反弹，如何抑制抗体的反弹尤为重要。可能需要进一步发现其它免疫原性较强的异种抗原并敲除。

2 难治性凝血功能紊乱

当异种肾移植受体移植肾功能出现恶化时，往往伴有血小板的迅速下降，发生严重的凝血功能紊乱，移植肾表现出广泛的微循环血栓形成和间质出血。即使移植后马上应用抗凝药物也无法抑制凝血功能紊乱，主要原因有：（1）低水平的抗猪抗体、补体和先天免疫细胞损伤或激活移植肾血管内皮细胞；（2）NHP和猪凝血-抗凝血系统之间的分子不相容性。活化的猪血管内皮细胞成为促凝剂，NHP体内发生的凝血过程不能被猪的抗凝血因子有效抑制，因此将人凝血调节基因如TM、内皮蛋白C受体（endothelial protein C receptor，EPCR）、组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）等转入猪的血管内皮细胞中，可以在一定程度上抑制移植物微循环血栓的形成，其中导入人TM是克服异种移植凝血功能障碍的最重要手段之一。在体外实验中，猪血管内皮细胞表达人TM可显著抑制凝血酶原活性，延迟人血浆凝血时间，诱导人血小板聚集的活性降低[15]。另外在抗凝系统起到关键作用的是EPCR，它同时也具有抗炎和保护细胞信号的作用。因此，在供体猪中过表达人EPCR可能是一种克服相关障碍的潜在解决方案，提供有效的抗炎、抗凝和细胞保护信号传导。在体外实验中，GTKO细胞表达人EPCR能减少血小板的聚集。人TFPI的表达是解决人组织因子（tissue factor，TF）与猪TFPI不结合的一个潜在途径。体外研究表明，人TFPI的表达可抑制TF活性[16]。在体外实验中，大部分研究都证实了猪细胞导入人凝血调控基因可以达到有效抗凝的效果。

体内实验表明，仅用GTKO/hCD55或者GTKO/β4GalNT2KO/hCD55的猪供肾，受体存活时间＞1年，未发生严重的微循环血栓[17]。而有些接受导入了人凝血调控基因的猪肾发生了严重的微循环血栓[18]，而且大部分跟急性排斥反应有关，特别是急性AMR。当抗原抗体结合后，激活补体的经典途径，生成攻膜复合物，破坏猪肾血管内皮细胞。当然，细胞性排斥反应也能激活CD8+T细胞进而损伤血管内皮细胞。因此笔者认为，如果能解决排斥反应对细胞的损伤，就能大大降低移植肾微循环血栓形成，如果排斥反应仍解决不了，导入2～3个人凝血调控基因仍可能无法有效抑制微循环血栓形成。然而对于慢性排斥反应，导入更多人凝血调控基因是否能在一定程度上起到抑制猪肾微循环血栓形成值得进一步研究。

3 持续存在的炎症反应

异种移植受体发生持续的炎症反应，在异种移植失败中起着重要作用[19-20]。当异种移植受体发生凝血功能紊乱时，促炎因子和趋化因子能推动异种排斥反应的发生，但能否导致炎症反应仍不清楚。在异种移植受体中可以检测到干扰素（interferon，IFN）-γ、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-12、IL-8、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1水平明显升高。在接受猪动脉片移植的受体狒狒中，以共刺激通路阻滞剂为基础的免疫抑制方案能有效减少IL-6的释放。IL-6与炎症和血栓并发症都有关，其还能促进组织因子的表达[21]，因此，抑制IL-6的释放可能对异种移植受体有益。

在异种移植术后数日内，受体C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平开始升高，且CRP水平升高发生在受体凝血激活和消耗性凝血功能障碍发展之前[22]。值得注意的是，CRP水平较高与凝血功能紊乱快速发展和异种移植肾早期衰竭均有关。异种器官移植受体全身并发症发生率的不同可能与异种器官的异质性和器官特异性血管基因表达有关。在异种移植受体猴安乐死后，移植心脏和肾脏中检测到CRP沉积。此外，在异种移植受体的肺中观察到CRP阳性的免疫细胞，表明发生了全身炎症反应。IL-6除了促进炎症反应，还可以诱导肝细胞和平滑肌细胞产生CRP[23]。在接受猪动脉片的狒狒中，IL-6和CRP水平之间存在显著的正相关，血液中CRP和纤维蛋白原水平之间也存在显著的正相关[18]。CRP和纤维蛋白原都是急性期的反应蛋白，在急性炎症反应中产生。

因此，抑制或者减弱炎症反应的发生，特别是抑制CRP和IL-6的释放可能对延长异种移植肾的存活有一定的作用。IL-6阻滞剂是目前用于异种移植中的一种抗炎药物，它能有效抑制异种器官移植受体血清CRP升高[24-25]。在同时接受IL-6阻滞剂和共刺激阻滞剂治疗的10例异种肾移植受体中，大部分长期存活，也有几例受体存活时间短，发生了AMR。在单独使用IL-6阻滞剂，而未加用共刺激阻滞剂的异种肾移植受体存活时间短。由此说明抗炎治疗对异种移植可能有一定的积极作用，但单独的抗炎治疗并不能有效延长异种移植肾的存活时间。

4 免疫抑制药的选择

免疫抑制药的使用对异种肾移植受体存活有很大影响。特别是CD154-CD40共刺激阻滞剂的使用。CD154也称为CD40配体或CD40L，主要表达于活化的T细胞，是TNF超家族分子的成员。它与抗原提呈细胞上的CD40蛋白结合，根据靶细胞类型产生多种效应。总的来说，CD40L有三个结合靶点：CD40、α5β1整合素和αIIbβ3。CD154作为一种共刺激分子，对T细胞亚群中的滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell，Tfh）尤其重要。在Tfh上，CD154通过结合B细胞表面的CD40促进B细胞成熟和功能，从而促进细胞间的交流。细胞表面CD154的缺失也会阻止生发中心的形成，从而抑制抗体亲和力，这是适应性免疫系统中的一个重要过程。

在异种器官移植中，有大量证据证明CD154-CD40共刺激阻滞剂的使用能明显延长移植受体的存活时间。虽然这种免疫抑制药在异种器官移植中取得了较好的效果，但抗CD154 单抗可能引起血栓并发症，其临床适用性仍然存在问题[26-27]。而已经有大量研究证实了抗CD40单抗在NHP同种异体移植和猪-NHP异种移植中的有效性[28-29]，且其在人同种异体移植中也有一定的效果[30-31]。目前，临床肾移植受者接受了一种新的抗CD40单抗的治疗研究，取得了一定的初步疗效[32]。另外的研究报道了一种靶向结合CD154的新型结构域的抗体，该抗体没有发生血栓栓塞并发症，并与其他抗CD154单抗具有类似的疗效。尽管CD154-CD40共刺激阻滞剂有很好的进展，但尚不清楚何时以及是否最终批准抗CD40单抗或抗CD154单抗应用于临床器官移植。

5 临床受者的选择

通过NHP模型能初步验证基因修饰猪的效用、免疫抑制方案的选择和移植术后排斥反应发生发展等科学问题，然而，因NHP模型自身的局限性，目前仍不能达到稳定的移植后移植物和受体长期存活。那么脑死亡器官捐献供者是否适合作为连接动物实验和临床试验的过渡？笔者所在团队前期开展的体外实验证实脑死亡器官捐献供者预存抗猪抗体水平明显较低，但具体原因不清楚。且脑死亡器官捐献供者存在多种不稳定因素，导致其难以长期维持稳定的血液循环。最近，人们已将10基因型猪肾移植至脑死亡器官捐献者，在3 d后终止实验，病理活组织检查未发现明显的排斥反应和微循环血栓形成[33]。虽然仅有3 d，但仍给我们提供了宝贵的实验数据。因此，采用脑死亡器官捐献供者作为异种器官移植受者模型有一定的应用价值，但仍需进一步探寻更具有实验价值的受者模型。

异种肾移植早期临床试验的安全性和有效性应该与长期透析治疗相比，而不是与同种异体肾移植的安全性和有效性相比较。因此，那些已经在等待接受肾移植名单，且接受同种肾移植的可能性不大的那些患者可以考虑进行异种肾移植，例如，部分B型或O型血的患者可能会在等待名单上等待7年甚至更长时间，其中年龄超过55岁的患者在等待肾源期间很有可能因并发症而死亡。因此，这部分患者可能是异种肾移植早期临床试验的最佳受者。

此外，对于高致敏的患者是否能接受猪肾这一问题，有研究发现HLA高水平患者中抗HLA抗体不会增加猪肾排斥反应的风险[34]。然而，又有一些研究证实抗HLA抗体与猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）之间存在交叉反应[35-36]。因此，对于早期的临床试验，为了避免任何交叉反应的风险，应选择非高致敏的患者接受猪肾移植。另外重要的是，有少量证据表明如果患者接受猪肾并产生抗猪抗体（如抗SLA抗体）而发生排斥反应后，并不影响受者继续接受同种肾移植[37]。因此临床试验中，猪肾移植虽然是以治疗为主要目的，但也可以有效地作为同种异体肾移植的桥梁。

6 交叉感染

排斥反应和感染的平衡是影响移植受体长期存活的一个重要因素，前者可以导致移植物失功，后者威胁受者的生命。在异种移植中，如果供体猪是在超洁净级的饲养环境下繁殖和圈养，那么移植的器官将不存外源性致病微生物[38]。因此，异种肾移植术后感染的发生风险可能与同种肾移植相似[39]。最近的一项研究表明，异种肾移植受体狒狒接受几个月的免疫抑制治疗后，未出现巨细胞病毒激活[40]。在异种移植中使用CD154-CD40共刺激阻滞剂为基础的免疫维持，同时加上抗胸腺细胞球蛋白、利妥昔单抗和糖皮质激素的免疫诱导，其免疫抑制强度明显高于同种肾移植，理论上更易发生感染。在短期存活的肾移植猪受体中，大部分死亡原因为排斥反应和消耗性凝血功能障碍，长期存活的受体中，一部分死于感染，但长期存活的例数并不多，无法得到充分的数据支持。无论如何，一旦异种移植受体可以得到长期稳定的存活，可考虑使用CD154-CD40共刺激阻滞剂作为基础的免疫维持方案。

人类内源性逆转录病毒（human endogenous retrovirus，HERV）在人体内并不具有致病性，猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）也似乎不会对猪的健康造成问题。然而，PERV是否在人类中具有致病性，以及是否会与HERV结合形成一种新的病毒，目前还不确定，但在目前动物实验和亚临床试验中均验证未出现PERV的传播。在体外实验中，用于治疗获得性免疫缺陷综合征的抗逆转录病毒药物可以有效抑制PERV。如果证实在异种移植远期或其他特殊情况下可能会出现PERV的传播，可以通过基因编辑技术阻断这一过程[41]，但其对猪肾功能的影响尚不得而知。

7 其它问题

7.1 高碳酸氢根

本团队前期研究发现异种肾移植猕猴受体均出现了血清碳酸氢根升高，可能是由猪肾和人肾的差异造成，但受体猕猴存活时间短，长期存活时血清碳酸氢根的浓度是否能恢复正常仍不得而知，需要进一步研究。

7.2 贫 血

猪的促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）在灵长类动物中是否发挥了充分作用，目前还存在疑问[42]。接受猪肾的NHP肾功能稳定时，仍会发生血红蛋白水平降低，可能与CD154-CD40共刺激阻滞剂的作用有关，对异种肾移植受者抽血的次数也比较频繁也可能是原因之一。即使证实猪EPO不能刺激NHP或人血红蛋白生成，也可以通过外源性的补充人EPO或者通过基因工程将人EPO导入猪细胞中。

7.3 猪肾迅速生长

将一个正在迅速增长期的猪肾移植至NHP，猪肾将在受体体内快速增长，就像它仍在猪体内一样。2～3个月后，其生长速度下降，并基本与受体狒狒的生长速度一致，且将一个正在迅速增长的猪肾移植到另一个生长缓慢的猪体内，移植肾的增长速度仍然很快[43]，表明这不是异种移植特有的问题。据推测，有一种先天因素导致了这种早期生长，敲除生长激素受体基因的猪肾或许可以解决这个问题[44]，但至今未用于猪-NHP肾移植模型中。2022年1月，美国马里兰大学医学中心将1颗基因修饰猪（敲除了生长激素受体基因）的心脏移植至1例心力衰竭的患者，受者在移植术后2个月后死亡，其具体的死亡原因仍不清楚。因此，对于移植至人的猪肾究竟能生长多大，仍然不清楚。笔者总结的近20年基因修饰猪-NHP异种肾移植体内研究情况见附表1（扫描二维码1可见）[4,10,17-18,45-64]。

扫描二维码1可见附表1

8 小 结

综上所述，虽然基因修饰猪-NHP异种肾移植取得很大的进展，但因NHP本身的局限性，未来研究者们应进一步探究猪-NHP异种肾移植中存在的排斥反应、凝血功能紊乱、炎症反应、交叉感染等问题，积极寻找可能解决的方法，选择最适的免疫抑制药和临床受者，促进临床异种肾移植的应用，解决更多终末期肾病患者的移植需求。