食品微生物检测中PCR 技术的应用探索

2022-11-16周宇晨耿思缘宋春璐夏元凤潘玉爱

食品安全导刊 2022年20期

周宇晨，耿思缘，宋春璐，夏元凤，潘玉爱

（大连产品质量检验检测研究院有限公司，辽宁大连 116000）

随着食品行业的快速发展，由微生物引起的食品安全事件频发，个别食品厂商为了盲目追求经济效益而忽略了食品微生物检测质量。因此在现阶段加强食品微生物检测质量变得十分重要，PCR 技术具有十分重要的技术应用价值，在全国各地具有比较广泛的应用[1]。

1 常见PCR 技术类型分析

PCR 技术的又叫聚合酶链式反应技术，初见于20 世纪80 年代中期，也被称之为基因体外扩增检测技术。应用过程中，针对靶NDA 双链进行加热变形，将其转化为单链结构，靶DNA 两端正邻近序列互补的寡核苷酸片段分为左端引物、右端引物，与互补DNA 单链碱基形成互补结合反应。在4 种dNTPs 底物以及DNA 聚合酶共存的情况下，这些引物会在模板DNA 链中逆时针进行延伸，并形成新DNA 双链，在循环反复几十次的反应后，可使靶DNA 序列扩增数百万倍，在食品微生物检测领域中体现出了较高的应用价值。就目前来看，现阶段的PCR 检测方法在以下几种技术中有较多的应用。

1.1 多重PCR 技术

和以往所用的传统PCR 技术比较类似，然而多重PCR 技术在相同的反应体系中，与传统PCR 技术相比多了一对或多对特异性引物，这些引物特异性互补模板共存条件下，可以从相同反应罐中扩增出相应数量的DNA 片段。多重PCR 技术实质上属于在传统PCR 技术的完善与发展下所形成的新型PCR扩增技术，可以在食物微生物检测过程中，将多种种类、数量的微生物得以有效检测出来，具有比较广泛的应用[2]。

1.2 实时定量PCR 技术

实时定量PCR 技术属于一种新型PCR 技术，不仅可以有效体现出PCR 技术的灵敏度与便捷性，还可以解决常规PCR 技术在应用过程中可能出现的假阳性污染问题，显著提高定量检测准确性效果，同时具有良好的重复性与低廉的费用成本。与传统PCR 技术的基本原理不同，定时定量PCR 技术在应用过程中，以荧光染料、探针来促进扩增特异性发展，荧光信号强弱与扩增产物量形成正比例关系，对保障定量检测的准确性具有重要意义。

1.3 PCR-ELISA 技术

该技术将PCR 技术与免疫酶技术进行结合，在食品致病性微生物的快速检测过程中体现出了较强的技术性。PCR-ELISA 技术所得检测结果与凝胶电泳方法所测结果相比，灵敏度更高，属于一种新型病毒DNA 检测技术。通过液相杂交法，使标记有生物素的PCR 扩增产物与特异探针呈液相混合，将探针与微孔板进行结合，酶标记抗体与杂交分子产生反应，在显色反应之后可以借助酶标仪准确读数以评估检测结果，具有较高的检测准确率。

2 在常见食品微生物检测过程中的PCR 应用探讨

2.1 沙门氏菌

对于许多食品而言，沙门氏菌数量相对比较少，主要原因在于食品在生产与加工过程中，会受到各种各样的原因，对食品中原有沙门氏菌产生一定的损伤作用，导致沙门氏菌含量显著下降，而这种现象很有可能导致食品微生物检测缺乏一定的准确性价值。多重PCR 技术可以有效鉴别出沙门氏菌的血清型信息，同时还可以检测出其中的突变状况，一般在比较常用的特异引物基因中包含invA、invB、invC、invE、fimA、hns 以及spvd 等。在相关研究中，有学者利用沙门氏菌的特异性基因hns、invA、invB 作为引物，多重PCR 技术检测应用过程中发现，二重PCR 与单一PCR 检测之间具有一定的相似性，而三重PCR 技术可以显著提高检测灵敏度，与常规检测方法相比之下，PCR 技术的检测检出率相对十分高[3]。

2.2 肠出血性大肠杆菌

在大肠杆菌中所产生的毒素普遍具有相似性，以往的单一PCR 技术难以有效鉴定出大肠杆菌以及出血性大肠杆菌之间的差异。通过多重PCR 技术的应用，在stx2、溶血素基因、贺霉素基因、紧密素基因以及脂多糖基因等目的基因中，开展食品微生物检测工作。有研究显示，在免疫磁分离技术以及多重PCR 技术的共同检测过程中，可以有效检测出牛肉中所存在的大肠杆菌，通过stx1、stx2、eae 及hly 等基因的分析，有效鉴别出大肠杆菌的主要类型[4]。在相同检测方法应用中，对牛肉中的大肠杆菌O157:H7流行因子，体现出了较高的检测效果，与以往的血清法检测结果相比，多重PCR 检测技术具有极高的检测准确性与灵敏度、实用性。

2.3 金黄色葡萄球菌

这类微生物在蔬菜、生肉中十分常见，具有较高的繁殖量，在繁殖结束后会形成肠毒素SE，并且很有可能出现食物中毒现象。而在肠毒素SE 检测过程中，通常需要针对sea、seb、sed、seh 及sei 等基因进行检测。在相关研究中发现，将肠毒素基因、金黄色葡萄球菌中的23S rRNA、编码耐热核酸酶基因进行结合而形成的PCR 检测方法，可以有效检测出牛奶、生肉中所存在的金黄色葡萄球菌。免疫检测法在检测应用过程中很难检测出肠毒素基因，需要应用更高灵敏度的检测技术，PCR 技术可以有效满足金黄色葡萄球菌的检测需求。

2.4 产单核李斯特菌

个别国家、地区中所出现的食品中毒事件中发现了主要致病菌是产单核李斯特菌，市场部门与食品检测部门对此十分关注，该致病菌很有可能使人类、动物产生相同的疾病，尤其在未经烹煮的食品、肉类中尤为常见，而易受该致病菌感染的人群主要为幼龄儿童、老年人以及存在免疫功能缺陷等人群。这种致病菌具有较强的耐低温性特点，可以在普通冰箱中正常繁殖，在部分防腐剂的应用中还可以体现出一定的抗性特点，因此很难有效清除食品中所存在的产单核李斯特菌。以往的致病菌检测需要先从样品中培养细菌，而PCR 技术可以直接在样品中进行，在李斯特菌感染的肉类产品中，应用半套式PCR 技术，可以模拟阳性牛奶致病菌，在存活10 个以上活菌的情况下，可以扩增出对应特异性产物，与传统PCR 技术相比，体现出了更为优异的检测灵敏度。在实际检测试验结果中发现，ERIC2PVR 技术可以通过扩增过程获取1 600 bp 的DNA 片段，在两种检测方法应用中所形成的检测结果十分相似。在PCR 扩增过程中可以发现李斯特菌中的inl 靶基因属于特有基因片段，然而现阶段并没有在该致病菌的其他类型中发现相应的基因片段，而通过对沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的检测结果对比中发现，实际检测结果均为阴性，因此在PCR 检测产单核李斯特菌中具有较高的检测价值。

2.5 非致病菌

相关研究显示，将rRNA ISR 与16S rRNA 共同构建形成多重PCR 技术，通过对真空包装中的牛肉进行检测，分别应用变形梯度凝胶电泳法与PCR 技术进行检测，在实际检测结果中发现，两种检测方法所得出来的结论基本相似，体现出了在发酵时间越长的情况下，非致病菌检出率越高[5]。在检测过程中，多重PCR 技术具有良好的重复性优势，有效解决了以往在16S rRNA 无法重复检测出泡菜中所存在的乳酸菌难题，体现出了优良的检测价值。

3 PVR 技术在食品微生物检测中的流程分析

3.1 引物设计

一般来说，扩增特异性的情况下，PCR 引物往往具有关键作用，PCR 引物质量与之具有密切的关系。引物一般待在分析基因组中的高度保守区域中，且长度一般是18 ～30 个碱基。对于多重PCR 引物而言，退火温度要尽量保持一致，可以有效满足引物在所选择的退火温度下具有相同的扩增效率，因此还要确保这些引物之间不存在各类相互作用影响。此外在引物设计过程中，还要结合分子生物学软件开展分析工作，要注意利用电泳以及其他方法，将所扩增的产物大小有效区分开。

3.2 制备模板

应用PCR 检测技术，为了能够保障PCR 检测可靠性，不仅依赖于检测方法的精准性，更依赖目标模板纯度以及目标分数数量大小，而在大多数情况下，PCR 检测技术要求富集步骤。在相关研究表明，在检测前阶段将食品原样中的细菌得以有效分离出来，并在浓缩、纯化过程中有效改善检测结果[6]。就现阶段而言，各类分离纯化方法在食品体系中的细菌浓缩过程中具有较为广泛的应用，其中阴阳离子交换数值、免疫磁性分离法、固定化凝集素等最具有代表性。