组学技术在茶叶研究中的应用进展

颜廷宇，余奇东，林全女，程福建，朱建新，杨江帆

1. 福建农林大学园艺学院（福州 350000）；2. 茶学福建省高校重点实验室（福州 350000）

茶叶是中国南方最重要的经济作物之一，其内含物质丰富，化学成分是由93.0%～96.5%的有机物和3.5%～7.0%的无机物组成，是一种天然的保健产品，具有抗氧化[1]、抗肿瘤[2]、降脂[3]、降糖[4-5]、降压[6]、抗动脉粥样硬化[7]、抗病毒[8-9]、抑菌[9-11]等多种保健和药理作用，可用于开发保健食品、抗心血管病和抗肿瘤药品、抗龋牙膏、天然食用色素、食品抗氧化剂以及环境净化剂等，具有广泛的应用前景。

组学技术能够获得一个生命体、组织或器官、单细胞的全部遗传信息、转录信息、蛋白及代谢产物，主要包括基因组学、蛋白组学、代谢组学、转录组学、脂类组学等。随着组学技术快速在茶叶领域发展，多组学研究时代已经成为当今茶叶领域的又一主流和热门研究。苏小琴等[12]通过组学技术对茶叶的栽培育种、种质资源特性、生理生化、加工及贮藏方向进行讲述，认为多组学分析将会成为今后茶叶品质机理探索的强大科研工具。虞昕磊等[13]讲述代谢组学分析茶叶品质形成的应用，通过讲述代谢组学技术在茶叶品质形成及调控、基因功能注释、栽培选育、揭示代谢网络调控机理等方面应用，认为代谢组学在茶叶领域取得了重大突破。程晓梅等[14]通过对蛋白组学在茶叶抗逆性、突变体等研究方面进行综述，认为植物蛋白组学发展迅速并取得了优质成果，对于茶叶蛋白组学的研究发展相对较慢。但随着新技术和理论的出现，茶叶蛋白组学研究会更加广泛和深入。前人多是从茶叶相关问题角度以及研究方向出发，讲述组学在茶叶领域的应用研究，然而对于从组学相关技术角度对茶叶研究讲述得较少，相关领域期刊重点均是在茶叶各领域，如栽培育种、抗逆胁迫、种质资源特性等。文章从各组学技术对茶叶科学领域研究进展进行讨论。

1 转录组学技术在茶叶研究中的应用进展

转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况，从整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科[15]。转录组受外部环境和内部因素共同控制，形成在不同发展阶段差异的基因表达情况[16-17]。转录组研究方法有高通量测序（high-throughput sequencing）、基因表达序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、互补DNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）、表达序列标签（expressed sequence tag，EST）等。目前，转录组学技术在茶叶研究中非常普遍，转录组学在茶叶抗性机理、品种资源以及次级代谢产物生物合成调控机制等方面得到了应用，并取得了重要成果[18]。

1.1 高通量测序技术

高通量测序技术是一次对几十万到几百万的DNA分子进行序列测定[19]。在茶叶科学领域，高通量测序技术多用于分析茶叶mRNAs和microRNAs的表达谱[20-21]，从而探究茶叶种质资源特性[22]、土壤菌落[23]、遗传多样性[24]、抗逆胁迫等[25-26]。随着高通量测序技术的迅速成熟，转录组学研究进入了一个新时代。研究者将高通量测序技术应用于研究转录本在组织和细胞中的种类和表达，转录组测序这一术语也逐渐被广泛使用[27]。陈林波等[28]通过高通量测序筛选调控“紫娟”花青素合成相关miRNA，通过差异表达分析，筛选出可能参与调控花青素合成的4个miRNA，包括miR828a、miR845c、novel14和novel87，其预测的靶基因包括转录因子基因MYB4、MYB23、MYB26、MYB82、bHLH74以及4-香豆酰辅酶A链接酶等基因。该研究结果为进一步开展茶树花青素生物合成的调控机制研究奠定基础，同时证明高通量技术非常适合用于茶叶中有效成分的筛选。

1.2 基因表达序列分析

基因表达序列分析可以利用9个核苷酸长度的序列标签代表特定的mRNA转录物，并对所有表达基因水平进行定性和定量分析，对检测低丰度表达的基因高度敏感[29]。它适用于发现生物体中尚未被测序到基因组中的新基因，也可为识别难以检测的开放阅读框和新基因提供证据。因此，这项技术的应用将有助于茶叶功能基因[30]、抗逆胁迫[31]、种质资源特性[32]等研究。近年来发展的方法可以同时分析两个或多个试验样本之间表达差异的所有基因[33-34]。陈暄等[35]通过3’/5’RACE获得低温诱导后特异表达的差异片段cDNA全长序列。所得序列全长981 bp，其开放阅读框编码275个氨基酸。该基因与白菜、烟草、拟南芥中的CBF基因编码的氨基酸序列分别有74%，57%和57%的同源性。用RT-PCR方法分析低温处理过程中CBF基因的表达情况，结果表明，CBF在低温诱导4 h开始表达，8 h左右达到高峰，随后下降，但仍维持较高水平。结果表明，CBF可能在茶树抗寒分子机制的形成过程中发挥重要的作用。

1.3 cDNA-AFLP

cDNA-AFLP是一种结合mRNA和AFLP差异显示技术的分子标记，具有独特的优点，如假阳性低、重复性好、多态性高、多功能性好、不需要基因组信息、对基因差异表达和转录信息反应准确等优点[36]。cDNA-AFLP是一种被用于植物转录阶段受生物胁迫所导致的基因表达。Gupta等[37]通过使用cDNA-AFLP方法鉴定茶叶因干旱胁迫而特异表达基因。聚类分析揭示了两种类型的聚类：Ⅰ型将耐性和易感品种分开，而Ⅱ型则将样品的时间点分开，这可以分为早期和晚期响应。

1.4 表达序列标签

表达序列标签是对组织或细胞基因组进行大规模cDNA克隆和测序获得的表达序列标签。EST表示某一特定时间在组织或细胞中表达的基因。表达序列标签数量的迅速增加已成为分子标记开发的重要资源[38]。在茶叶科学研究中一般采用cDNA文库和EST测序技术对茶叶分子生物学进行探索，包括EST-SSR/STR标记开发应用，抗性胁迫基因和次生代谢基因克隆与表达等，加快对茶叶生长代谢的探索和认识，并取得了一些重要进展，对研究抗逆性的分子机制具有积极意义。Taniguch等[39]通过构建7个来自不同器官的cDNA文库，并利用文库生成ESTs，获得17 458条EST序列，组装成5 262条非基因序列。利用100对EST-SSR引物对茶叶进行了扩增和多态性分析。71对引物成功扩增出EST-SSR，70个EST-SSR位点表现出多态性。EST加强茶树等茶属植物重要性状和分子遗传学的研究。

2 蛋白组学技术在茶叶研究中的应用进展

蛋白质组学是生物研究中发展最快的领域之一，通过蛋白组学的研究，能快速分离鉴定与控制植物重要农艺性状的蛋白质，运用逆向遗传学方法鉴定基因功能，再利用基因工程手段将优良的农艺性状基因转化农作物，以进一步提高作物产量、品质和抗逆性[40]。

2.1 双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2DE）

2DE是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术[41-42]，根据蛋白质的等电点和分子量，对凝胶进行等电点聚集和电泳，以纯化和区分复杂的蛋白质组成。Chien等[43]通过2-DE和Nano-LC/MS/MS结合IGAE和SVM-FS的双层特征选择机制去识别乌龙茶原产地标记的特征蛋白。准确率高达为95.5%。该方法可为进一步研究茶叶蛋白质组学奠定技术基础，也为其他经济作物中蛋白质的分离鉴定提供科学依据。

2.2 双向荧光差异电泳（two-dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）

双向荧光差异电泳是基于双向凝胶电泳和多重荧光分析的方法，特点是：每个蛋白质点都有自己的内部标记，每个蛋白质点的自动校准很好地消除了样本中的假阳性。双向荧光差异电泳技术统计可靠性在95%以上。李勤等[44]运用双向电泳等方法研究叶绿体蛋白表达差异研究阶段白化过程，探讨茶叶白化的分子机制，将差异表达蛋白质凝胶酶水解，经酶法水解肽提取、真空浓缩、质谱检测等处理鉴定，样品绿体在前期、白化期和复绿期共鉴定其中差异表达蛋白59个，质谱鉴定蛋白22个。试验最终表明白化现象与生理功能相关。

3 代谢组学技术在茶叶研究中的应用进展

代谢组学在基因组学和蛋白质组学的基础上，对某一生物体内在特定时期所产生的低分子量物质进行定性定量分析[45-46]。根据对象不同，代谢组学可分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学[47]，反映生物体系受外界胁迫或基因变异的代谢产物变化情况，从而揭示其生命活动规律与调节机制。目前，代谢组学在茶叶研究中的应用集中于研究农药残留、加工工艺、环境胁迫以及地域差异等[48-49]。代谢组学中使用的分析工具包括核磁共振技术（NMR）、液相色谱-质谱（LC-MS）与气相色谱-质谱（GC-MS）等[50]。

3.1 核磁共振技术

核磁共振技术作为结构分析的手段，已被广泛应用于化学、结构生物学等多个领域，NMR技术能够在不破坏样本的基础上实现快速准确分析，但是不够灵敏[51]。如果样品为固体或半固体，测试前将样品搅碎，加入缓冲液中提取，若样品为液体，则样品不需要复杂的预处理。提取后可检出含氘代水的磷酸盐缓冲液[52-53]。由于对样品破坏性小，适用于复杂体系，是代谢组学研究过程中比较常见的方法[54]。在NMR共振研究中，最常用的有核磁共振氢谱（1H-NMR）、核磁共振碳谱（13C-NMR）、核磁共振氮谱（15N-NMR）、核磁共振磷谱（31P-NMR）。Mozumder等[55]的多元统计分析与1H-NMR分析表明，不同茶树龄的鲜茶叶代谢差异明显。茶氨酸、谷氨酰胺、儿茶素、没食子儿茶素等多种茶叶代谢产物随茶树年龄的变化而变化，茶氨酸代谢在嫩茶树和老茶树之间存在差异。

3.2 液相色谱-质谱

液相色谱-质谱具有准确度高、分离范围广、速度快的特点，可运用到生物学[56]、中药学[57]、化学[58]、临床医学[59]等学科之中。Zhou等[60]为了研究大叶黄茶在加工过程中的化学变化，采用高效液相色谱和LC-MS对各工序的样品进行了定量分析和定性分析。基于LC-MS的非靶向和靶向代谢组学分析表明，烘焙后的茶叶样品与烘焙前相比有明显的差异，表儿茶素和游离氨基酸的含量显著降低，而儿茶素的含量显著增加。Ge等[61]采用5-（diisopropylamino）amylamine（DIAAA）derivatization-UHPLC-Q-TOF/MS法对普洱茶中酚酸进行了定性定量研究，揭示了发酵对普洱茶酚酸的影响及其潜在效应。试验测定了33种酚酸，其中大部分为首次在普洱茶中检出。熟普和生普的主要成分分别为没食子酸和茶皂素。试验表明在普洱茶发酵过程中，大部分酚酸酯含量下降。液相色谱-质谱在茶叶生化成分的定性定量、指纹图谱以及农药残留等方面的研究中得到广泛应用。

3.3 气相色谱-质谱

气相色谱-质谱具有分析范围广、准确性高、速度快、对化学物的破坏性小、不需复杂操作和复杂经验、适合对有机物质和生物性物质的优点[62]。现阶段从茶叶原叶以及成品茶中已分离鉴定的茶叶芳香物质有700余种，包括醛、醇、酮、酯、酸和含氮类等10余大类化合物。气相色谱-质谱常用于产地鉴别、指纹图谱、农药残留以及品质鉴定等方面[63]。Wang等[64]通过SBSE/GC-MS对龙井茶中的挥发性物质进行了提取和分析。分析鉴定出来151种挥发性化合物，醇、烷烃、醛和酯四大类化学物质占挥发性化合物总量的54%。香叶醇是龙井茶中含量最丰富的挥发性化合物，其次是己醛和β-紫罗兰酮。通过气相色谱-嗅觉仪分析、气味活性值计算和香气重组初步试验，鉴定出龙井茶的主要香气成分，包括2-甲基丁醛等14种挥发性化合物。龙立梅等[65]采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱对信阳毛尖茶41份样品进行研究，建立了7个不同等级茶叶香气成分的GC-MS指纹图谱。根据所选取的23种特征香气成分，通过判别分析，将样品分为4组和3组。采用6种不同程度反映茶叶品级差异的指纹相似度计算方法，改进后的指纹相似度计算方法是其中最好的。

4 脂质组学技术在茶叶研究中的应用进展

脂质组学已成为组学领域的一门新兴科学[66-67]。脂类是生物重要的生物分子，在茶叶细胞功能中细胞凋亡、信号传导、物质运输和能量储存等方面发挥着重要作用[68-69]。随着对脂质组学研究的不断拓展与深入，脂质组学分析技术越来越多元化，主要包括NMR、LC-MS、GC-MS、薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）[70]、毛细管电泳-质谱联用（capillary electrophoresis-mass spectrometer，CE-MS）[71]、电喷雾电离质谱（capillary electrophoresis-mass spectrometer，ESI-MS）[72]、“鸟枪法”（shotgun lipidomics）[73]、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）[74-76]等。脂质组学要比其他组学起步较晚，最早的脂质组学论文出现在2003年[77]。脂质组学在应用方面广阔，分析方法越来越呈体系[78]。但与其他组学相比，脂质组学研究不深入，导致研究领域对脂质组学的了解很少。但脂质组学在植物上面的研究却是有着巨大的潜力，脂质组学的发展将促进生物学、医学和生命科学相关领域的发展。因此，在植物学以及茶学领域中开展脂质组学的研究将为茶学发展提供一个崭新的视角。

5 结语

如今组学研究已经成为茶学的主流研究方向，其中转录组学、蛋白质组学和代谢组学为基础的组学技术，在茶叶学科领域多方面开展研究。组学已成为茶叶研究的强有力工具。茶叶特有次生代谢基因现在成为基因发现的活跃领域。组学技术应用虽然可以应用在茶叶生长发育、特色种质资源、抗逆胁迫等相关研究，但是中国领土跨越大、气候差异明显、品种资源繁多、茶叶种类各异等，因此今后通过组学研究解决以上所带来的茶叶品质差异和基因表达带有巨大的突破，而近些年茶叶研究结合转录组学、代谢组学和蛋白组学连用等分析茶叶基因调节、特色种质资源、抗逆胁迫，并取得了许多成果。多组学的整合使代谢组之间能够相互验证，可以深入分析茶叶基因表达与各种生物系统的代谢机制之间的关系。总而言之，茶叶多组学研究分析必将成为解决茶叶科学现存问题的强有力工具与研究方向，对进一步解决茶叶栽培育种、抗逆胁迫、产地鉴别等发挥重要作用。组学技术发展极大地推动了茶叶研究进程。