食品中单增李斯特菌检验技术研究进展

敖威华，李菁雯，陈林军，赵治国，刘丹，崔强*

1. 呼和浩特海关技术中心（呼和浩特 010020）；2. 二连海关技术中心（二连浩特 021600）

随着生活水平的大幅提高，人们对食品质量的要求也越来越高。食品质量在人们生活中所占比重逐步增加。打造质量强国战略，食品行业在快速发展，规模也在不断地扩大，而在发展过程中，食品安全问题也在逐年增加，尤其是食源性病原微生物的频发，严重威胁我国食品行业的发展。微生物检验作为一项重要的技术手段，为保障食品安全提供强有力的科学依据。我国对于食品中单增李斯特菌的检测和鉴定仍停留在传统的分离培养、鉴定和血清型等GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》描述的检测方法上。现有检测方法通常是培养法，但采用该方法也有很多的弊端，如检测灵敏度不高，对目标菌和杂菌的检测容易漏检，此外对于检测结果中菌类计数会因不同检测人员不同的计数方法会有差异。这些方法不仅需要时间长、操作繁琐，而且特异性不强、灵敏度也不高。因此，从食品安全现状和食品微生物检测技术等关键问题出发，建立符合我国国情的食品安全检测体系，可有效控制和预防食源性致病菌的传播、发展。

食品微生物检验技术的发展和应用成为大势所趋，尤其是食品安全检测部门更加注重其发展潜能。食品微生物检测方法为食品的安全提供强有力的科学依据。食品微生物的检测关系着食品的安全，而食品安全又关系着人体健康。因此，食品微生物检测是关乎食品安全的关键因素。食品中单增李斯特菌的检测是衡量食品卫生与安全的重要指标之一，也是判定被检食品能否适用的科学依据之一；通过食品中单增李斯特菌的检测，可以判断食品加工环境及卫生情况，对食品被致病微生物污染的程度作出正确的评价，为各项食品安全管理工作提供科学依据；对食品微生物检验可有效预防或减少食物中毒和人畜共患病的发生；对提高产品质量、避免经济损失、保证出口等方面在政治和经济上都具有重大意义。

1 微生物检测的常规方法

多年来，对于食品中单增李斯特菌的检测通常采用GB 4789.30—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》中的平板培养法，该方法不仅耗时长，而且容易造成结果数据的误差，从而影响试验结果。近几年，检验检测机构致力于快速检测技术和方法的研究，以提高食品中单增李斯特菌检测的准确性和可靠性，其中的常规新方法有以下几种。

1.1 显色培养基技术

显色培养基微生物快速检验技术是指借助于微生物所对应的种属特异酶，在培养基中加入与之对应的显色酶，在微生物生长代谢过程中产生酶，发挥对底物的水解效果，从而对培养物进行着色，实现对微生物的准确鉴定。法国研究人员于1974年首次开发显色培养基，并将其应用于对大肠杆菌的检验中，后期应用范围不断扩展，价值日益凸显。显色培养基已被应用于对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌等快速检测过程中，检测人员可以根据不同菌群在不同的显色培养基的显色效果，可快速检测，判定该菌群种类。此外，根据着色的差异还有快速纸片法，在单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等微生物的检测中具有快速、准确的优势。

1.2 电阻抗法

电阻抗法是近年来发展起来的一项生物学技术。电阻抗法的技术原理是细菌在琼脂培养基内生长繁殖的过程中，导致培养基中大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质等代谢为活性小分子物质，从而增强琼脂培养基的导电性，改变培养基的电阻抗，通过检测电阻抗来判定培养基中细菌的生长繁殖情况[1]，判定细菌在琼脂培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该方法已被用于单增李斯特菌、菌落总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等病原微生物的检测[2]。

1.3 免疫磁珠的分离方法检测

阳性分离法磁珠结合的细胞即为所要分离获得的细胞，而阴性分离法磁珠结合不需要获得的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞，采用免疫磁珠的分离方式，将特异性抗体与磁珠颗粒的表面进行关联，可将样品中的微生物进行特异性结合，通过外部磁场的作用，装有病毒的微生物磁珠会在其作用之下向两端靠拢，可使微生物从样品中分离出来。这种方法相对于普通检测方法而言，可以在含有大量细菌的溶液中，选择性地将微生物分离出来，具有较高的检出效率[3]。一般来说，阴性磁珠分离法比阳性分离法用的磁珠多，因此选择阳性磁珠分离的方法较多。但该方法会对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于细菌分离后的培养，而且成本较高，操作较为繁琐，不利于在实验室进行微生物的快速检测。

1.4 纳米装置

纳米装置就是根据纳米粒子的特性，把纳米粒子用于标记物检测装置。当物体的尺度小到纳米尺度时，就会表现出与宏观尺度物质不同的性能，因此称为纳米效应。纳米效应可作为生物分析标记物质，能够极大地改善标记物性能，显著提升灵敏度[4]。虽然该方法检测的试验数据灵敏度高、特异性较强，但就目前检测实验室的整体情况而言，该方法在应用上还有较大难度。

2 微生物检测的分子生物学技术

分子生物学技术是一种现代新型的分子技术，在食品微生物检测过程中，主要是在分子水平上分析微生物的线性结构以认知样本中的微生物类型，其主要优点是特异性强、灵敏度高。Liu-Stratton等[5]证实分子生物学技术在食品检测中应用广泛，分子生物学检测与基因的表达对食品检测具有重要意义。

2.1 可视化基因芯片技术

基因芯片以其高灵敏度、高通量的特点逐渐成为致病微生物检测研究的热点，对于普通的基因芯片在杂交反应结束后还需使用荧光扫描显微镜对结果进行分析，给实验室在使用上造成一定困难。为解决基因芯片试验结果处理与分析的难题，开发一种新的芯片技术——可视化基因芯片技术。Ostroff等[6]证实酶在催化作用下产生沉淀，并沉积于基因芯片表面，使基因芯片的厚度发生明显的变化，导致反射在基因芯片上光的波长发生实质改变，通过基因芯片上颜色的变化来观察试验结果。可视化基因芯片技术检测效率高，操作方便快捷，能够在较短时间内得出检测结果，虽然一次可视芯片技术检测能够检测出多种潜在致病菌，但是由于可视化基因芯片检测技术成本较高，操作要求比较繁琐，因此，未在食品安全领域有较多推广[7]。

2.2 荧光标记噬菌体技术

荧光标记噬菌体技术是根据噬菌体特异性侵染宿主菌的原理，选用合适的染色剂将噬菌体的核酸进行染色标记，用标记过的噬菌体侵染相应的宿主菌，噬菌体吸附在其宿主菌表面后，随即将标记过的核酸注入宿主细胞，随着越来越多的噬菌体核酸的注入，细胞内荧光随着荧光素的增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌的存在，从而实现病原菌的检测[8]。Mosier-Boss等[9]在前人基础上，将荧光染料YOYO-1更换为灵敏度较高，且对噬菌体结构和功能都无破坏性的SYBR gold核酸染料标记沙门菌噬菌体P22，成功检测到沙门菌LT2株，同时与核酸染料作对比，结果显示SYBR gold染剂是试验效果最好的核酸染料；Phea等[10]与Flajshans等[11]分别将SYBR greenⅠ和SYBR green Ⅱ用于单增李斯特菌、大肠杆菌及沙门菌的检测，均成功检出，且灵敏度较高，特异性强，该方法完全可用于实际生产中微生物的检测。多数噬菌体与宿主呈一一对应关系，虽特异性极高，但宿主范围较窄，且噬菌体与宿主作用的裂解机理尚不明确，有待进一步研究，所以该技术在实践中的应用相对较少。但是荧光标记噬菌体技术，检测周期短，能区分死活细菌，准确性好，检测前无需将细菌纯化，预增菌后即可用于检测，整个过程可在8 h内结束，且可以对多个细菌进行同步检测，因此该项技术在食源性致病菌的检测中有广阔的发展前景。

2.3 荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新的定量检测技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR的产物进行标记，使用荧光定量PCR仪对图示结果进行分析，计算出待检样品的初始浓度[12]。Cheng等[13]利用设计的引物和探针检测沙门菌的262 bp基因片段，Bialek等[14]荧光定量PCR-探针法分析药物分子含量。荧光定量PCR技术根据已知细菌的遗传信息，设计特定的引物探针扩增序列，根据是否有特定长度扩增产物的出现判断是否存在检测的目标细菌[15]。该方法用于微生物及病原菌毒素检测具有快速、灵敏、特异性强等优点[16]。此外荧光定量PCR技术可实现多通道、多项目的检测，在食品中单增李斯特菌等致病菌检测中发挥重要作用。

2.4 基因探针技术

生物技术用于食品检测是十分常见的技术手段，尤其是一些富含大量微生物的食品，如在酸奶、乳酸菌饮料中含有大量对人体有益的菌类，如何正确区分有益菌和致病菌，只有依靠生物技术才能实现。基因探针技术在这一点上表现得十分出色，能准确地检测出食品中的菌类[17]。基因探针技术是用一段已知基因的核酸序列作为探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，若两者的碱基完全配对，可互补结合成双链，表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。该技术具有特殊性强、灵活性高、操纵便捷、省时等优势。但该技术也有局限性，主要体现在成本高等方面。

2.5 微滴数字PCR技术（micro drop digital polymerase chain reaction，ddPCR）

微滴数字PCR扩增前是将一个大的反应体系进行微滴化处理，利用油包水技术将其“分割”为数万个纳升级的微滴[18]，每个微滴或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并且每个微滴都是一个独立的PCR反应体系。根据阳性微滴的个数与比例，利用泊松分布原理得出靶分子的起始拷贝数，从而实现对最初反应体系中核酸靶分子数的绝对定量[19]。该方法在传统的PCR扩增前将含有核酸分子的反应体系进行有效分割，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性反应单元数，计算出检测样本的DNA分子数目[20]。由于ddPCR技术降低了对反应扩增效率的要求，可以有效胜任许多稀有变异的检测工作。ddPCR技术采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与传统的普通PCR和荧光定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。ddPCR技术比传统的荧光定量PCR方法更加准确，特异性更强，灵敏度更高，能够做到绝对定量。该技术在微生物检测、转基因检测、地沟油检测、动物疫病检测、疾病检测以及质检领域的研究和应用中已凸显优势，随着微滴数字PCR仪的普及应用，该技术必将被广泛应用于生命科学的各个领域。

2.6 叠氮溴化乙锭-聚合酶链式反应（ethidium monoazide bromide-polymerase chain reaction，EMA-PCR）检测技术

将EMA与荧光定量PCR技术相结合，能够有效、快速地检测出食品中的食源性致病菌，而且EMA作为DNA结合染料，能够快速渗透细胞壁，穿透细菌的细胞膜，从而进入细胞体内。通常死细胞的细胞膜已遭到破坏，EMA很容易渗透到细胞内部，插入到细胞内DNA双螺旋上。但活菌的细胞膜比较完整，EMA不能渗透到活细胞内。选用一定浓度比例的EMA与菌液结合，经过高强度的钨灯照射处理，插入到DNA双螺旋上的EMA能够与DNA双螺旋发生共价交叉偶合，且这种共价偶合具有不可逆性，抑制后续PCR扩增中引物与死菌DNA的结合，从而达到区分死活菌的目的[21]。该方法的建立能够快速、准确地区分、鉴定死菌和活菌，与普通PCR方法比较，大幅降低假阳性结果。该方法具有检测结果准确、检测周期短、灵敏度高等特点，在食品中单增李斯特菌等致病菌微生物检测领域应用前景广泛。

3 结语与展望

从分子学角度来看，单增李斯特菌检测技术的发展从普通的培养基培养法，再到后来的PCR技术、荧光定量PCR方法和绝对定量PCR技术，实现微生物检测从定性到绝对定量的质的发展。微滴式数字PCR技术是近年来发展起来的绝对定量技术，该方法是在PCR扩增前将含有核酸分子的反应体系进行有效分割，微滴式数字PCR技术的定量检测限比传统PCR技术低，特异性、重复性和传统定量PCR也存在极大的优势。鉴于这种微滴反应能极大程度分散反应体系，可以有效消除抑制因子的作用，保证检测过程中的扩增效率，对检测低含量目标核酸分子的样品有良好的效果[22]。因此，在微生物检测与研究中，可将EMA与微滴式数字PCR技术相结合，用于活体微生物的检测，运用其绝对定量检测的优点，应用在日常的微生物检测过程，其与常规PCR检测技术相比最大的不同就是当检测相同样品数量时，运用EMA与微滴式数字PCR技术检测的时间短、灵敏度高，而且能够做到绝对定量。

食品安全问题与人体生命健康紧密相关，分子生物学技术能够快速、准确地检验食品微生物数量和种类，是评价食品是否合格的重要标志之一，对促进食品行业的快速发展、提升食品安全质量具有重要的现实意义。因此，应加大对食品微生物检验技术的投入，使食品质量更加安全可靠。运用简便、快捷的分子生物学方法不仅可以在食品微生物检测过程中提高检出率，而且在人畜共患病的诊断等方面也有广阔应用前景。